Xây dƣ̣ng quy trình real-time As-PCR

I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU A Mục tiêu tổng quát.

4. Xây dƣ̣ng quy trình real-time As-PCR

Khảo sát hiệu quả nhân bản của primer real-time As-PCR

Mục tiêu thí nghiệm nhằm khảo sát hiệu quả nhân bản của các cặp primer trên bộ gene người.

Chúng tôi tiến hành đánh giá hiệu quả hoạt động của hai loại primer bằng cách lần lươ ̣t cho mỗi loa ̣i chứng dương vào mỗi mix : pAmpC vào mix C (ký hiệu C- KaC), pAmpT vào mix C (ký hiệu T-KaC), pAmpT vào mix T (ký hiệu T -KaT), pAmpC vào mix T (ký hiệu C -KaT). Kết quả cha ̣y real -time PCR được thể hiê ̣n qua hình 2.8

Hình 2.8. Kết quả khảo sát hiệu quả nhân bản primer real-time As-PCR.

Các sản phẩm PCR được đem giải trình tự để kiểm tra sự tương đồ ng với trình tự MCM6 (hình 2.9).

55

Hình 2.9. Kết quả sắp gióng cô ̣t trình tƣ̣ với gene MCM6

Kết quả cho thấy cả bốn nghiê ̣m thức đều cho nhân bản chính xác vùng gene MCM6. Đồng thời , cặp chứng dương -mix bắt că ̣p đúng (C-KaC và T -KaT) có hiê ̣u quả nhân bản tốt hơn că ̣p chứng dương -mix bắt că ̣p sai (C-KaT và T-KaC). Các yếu tố như Taq , Mg, dNTP, nồng đô ̣ primer , probe đã được phối trô ̣n trong master mix như theo khuyến cáo của nhà sản xuất . Hai yếu tố còn la ̣ i có ảnh hưởng là nhiê ̣t đô ̣ lai của primer và nồng độ bản mẫu cho vào phản ứng.

Khảo sát nhiệt độ lai

Thí nghiệm được tiến hành trên 2 loại mẫu chứng dương pAmpT , pAmpC; mỗi loại mẫu được lặp lại 4 lần. Chúng tôi thực hiê ̣n phản ứng PCR với mix Lac - AsPCR (đã chứa sẵn mời ngược Lac 3r) và chương trình ln nhiệt Lac -AsPCR (nhiệt đơ ̣ lai là dãy gradient từ 60oC đến 64o

C). Các nghiệm thức được bố trí như bảng 2.4.

Bảng 2.4. Các nghiệm thức khảo sát nhiê ̣t độ lai primer Kambara

Nghiê ̣m thức f-Primer As-PCR Loại mẫu

T-KaT Ka-f(T) pAmpT Bắt că ̣p đúng C-KaT Ka-f(T) pAmpC Bắt că ̣p sai T-KaC Ka-f(C) pAmpT Bắt că ̣p sai C-KaC Ka-f(C) pAmpC Bắt că ̣p đúng Bốn nghiê ̣m thức được khảo sát nhằm xác đi ̣nh nhiê ̣t đô ̣ lai tốt nhất mà hai primer Kambara có thể phân biê ̣t được 2 allele của SNP LCT -13910. Nghiê ̣m thức T -KaT và C -KaC là hai nghiê ̣m thức bắt că ̣p đúng . Kỳ vọng với cả hai nghiê ̣m thức là primer cho phép quá trì nh nhân bản bản mẫu và tạo tín hiệu huỳnh quang . Giá trị Ct của hai nghiệm thức này cần phải không chênh nhau không quá 3,32 Ct. Nghiê ̣m thức C -KaT và C -KaT là hai nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai. Kỳ vọng với cả hai nghiệm thức là p rimer ngăn quá trình nhân bản bản mẫu và sẽ không được ghi nhận hoặc ghi nhận rất yếu . Giá trị Ct của hai nghiệm thức này cần không xác định hoặc đều gần Ct 35.

Kết quả thí nghiệm được thể hiê ̣n dưới da ̣ng giá tri ̣ Ct -MCM6 như trong bảng 2.5.

56

Bảng 2.5. Kết quả real-time PCR khảo sát nhiê ̣t độ lai của primer Kambara

Nghiê ̣m thức

Nhiê ̣t đô ̣ T-KaT C-KaT T-KaC C-KaC

60,0 o o C Lần 1 20,96 27,07 28,53 21,16 Lần 2 20,79 27,14 28,91 21,14 Lần 3 21,03 27,07 27,67 21,05 Lần 4 21,05 27,22 27,84 21,36 Trung bình 20,96 ± 0,12 27,13 ± 0,07 28,24 ± 0,58 21,18 ± 0,13 61,0 oC Lần 1 21,16 27,15 28,66 21,79 Lần 2 20,45 27,22 29,04 21,23 Lần 3 21,43 27,37 28,24 21,25 Lần 4 21,56 27,22 27,97 21,57 Trung bình 21,15 ± 0,50 27,24 ± 0,09 28,48 ± 0,47 21,46 ± 0,27 62,2 oC Lần 1 21,43 28,42 30,56 21,97 Lần 2 21,92 28,79 31,54 22,70 Lần 3 21,27 27,56 30,41 22,38 Lần 4 22,10 27,73 31,00 21,63 Trung bình 21,68 ± 0,40 28,12 ± 0,58 30,88 ± 0,51 22,17 ± 0,47 63,2 o C Lần 1 21,97 29,5 32,95 22,40 Lần 2 20,95 30,18 34,04 23,14 Lần 3 22,45 28,56 32,44 24,56 Lần 4 22,48 28,63 32,33 22,27 Trung bình 21,96 ± 0,71 29,22 ± 0,77 32,94 ± 0,78 23,09 ± 1,00 63,7 oC Lần 1 23,68 29,46 33,05 24,72 Lần 2 22,40 31,43 32,73 23,52 Lần 3 24,28 31,38 34,11 22,74 Lần 4 22,70 29,05 32,31 23,51 Trung bình 23,26 ± 0,87 30,56 ± 1,00 33,05 ± 0,77 23,62 ± 0,82

Kết quả bảng 2.5 cho thấy: hai că ̣p nghiê ̣m thức bắt că ̣p đúng (T-KaT và C-KaC) luôn cho giá trị Ct không chênh quá 3,32 Ct và độ lệch chuẩn giữa các lă ̣p la ̣i của từng nghiê ̣m thức không chênh quá 1 Ct. Khi tăng nhiê ̣t đô ̣ lai , giá trị Ct của tất cả nghiệm thức c ó khuynh hướng tăng dần . Tại 60oC, hai cặp nghiê ̣m thức T - KaT và C -KaC cho hiê ̣u quả nhân bản cao nhất , đô ̣ lệch chuẩn trong các lần lă ̣p

57

lại nhỏ nhất và sai khác giá trị Ct giữa hai nghiệm thức (T-KaT và C -KaC) nhỏ nhất 0,22 Ct.

Hai cặp nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai (C-KaT và T-KaC) luôn cho giá trị Ct xác định, nhỏ hơn mức Ct 35 nhiều lần. Độ lệch chuẩn giữa các lần lă ̣p la ̣i của từng nghiê ̣m thức không chênh quá 1 Ct. Khi tăng nhiê ̣t đô ̣ lai , giá trị Ct của tất cả nghiệm thức có khuyên hướng tăng dần . Nhìn chung, mỡi nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai luôn có giá trị Ct cao hơn 6-8 Ct so với nghiê ̣m thức bắt că ̣p đúng cùng loa ̣i primer (C- KaT so với T-KaT, T-KaC so với C-KaC). Tại 60o

C, hai cặp nghiê ̣m thức C-KaT và T-KaC cho hiê ̣u quả nhân bản cao nhấ t và sự sai khác giá trị Ct giữa nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai so với nghiê ̣m thức bắt că ̣p đúng cùng loa ̣i primer từ 6,17 đến 7,06 Ct.

Như vâ ̣y, nhiê ̣t đô ̣ lai tốt nhất với các phản ứng sử du ̣ng primer Kambara là 60oC. Các c ông trình khác sử dụng primer Kambara cho thấy loa ̣i primer này có khả năng phân biê ̣t giữa các SNP mô ̣t cách rõ ràng (kết quả điê ̣n di xuất hiê ̣n hoă ̣c không xuất hiê ̣n va ̣ch chứa SNP ) (Hirotsu 2010, Huang 2006). Trong khi đó , primer mà chúng tô i thiết kế tuy cũng có thể phân biê ̣t SNP nhưng vẫn còn hiê ̣n tươ ̣ng dương tính giả ở các nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai . Xem xét các thành phần cho vào phản ứng giữa thí nghiệm của chúng tơi với các cơng trình khác , chúng tơi cho rằng hiện tươ ̣ng dương tính giả này có hai nguyên nhân . Mô ̣t do đô ̣ nha ̣y của hỗn hơ ̣p phản ứng quá cao ; khả năng do master mix sử dụng vốn được thiết kế cho các phản ứng đa mồi , cần đô ̣ nha ̣y cao ). Hai do nồng đô ̣ bản mẫu quá ca o; các cơng trình nghiên cứu trước sử dụng nồng độ bản mẫu 50-100 ng, tương ứng 102 - 103 bản sao một gene trong mỗi microlit ; trong khi nồng độ bản mẫu dùng trong nghiên cứu là 105

bản sao một gene trong mỗi microlit . Đồng thời , các công trình nghiên cứu cho thấy khi nồng đô ̣ bản mẫu cao thì có khả năng ta ̣o nên hiê ̣n tượng dương tính giả (Biosyn 2010, Kugelman 2009). Do các điều kiê ̣n nghiên cứu không cho phép thay đổi master mix , chúng tôi chỉ có thể tiến hành khảo sát giảm nồng độ bản mẫu.

Khảo sát nồng độ bản mẫu

Kỹ thuật As-PCR là ta ̣o hiê ̣n tượng dương tính giả khi nồng đô ̣ bản mẫu quá cao. Mục tiêu của chúng tôi là xác định nồng độ bản mẫu cho vào ống phản ứng sao cho các nghiệm thức bắt cặp sai không cho kết quả dương tính. Trong thí nghiê ̣m kiểm tra quy trình PCR-RFLP, các nghiệm thức bắt cặp sai C-KaT và T-KaC có giá trị Ct khoảng 28,5 đến 30 Ct. Trên lý thuyết, khi giảm nồng đô ̣ bản mẫu 100 lần thì giá tri ̣ Ct giảm 6,64 Ct. Như vâ ̣y, các nghiệm thức bắt cặp sai có thể có giá trị Ct ngoài 35 Ct. Do vâ ̣y, chúng tơi tiến hành thí nghiệm giảm nồng độ bản mẫu.Thí nghiệm được tiến hành trên 2 loại mẫu chứng dương pAmpT, pAmpC, đươ ̣c thực hiê ̣n phản ứng PCR với mix Lac-AsPCR (chứa sẵn mồi ngược Lac3r) và chương trình ln nhiệt Lac-AsPCR (nhiê ̣t đơ ̣ lai là 60oC). Các nghiệm thức đươ ̣c bố trí như bảng 2.6.

58

Bảng 2.6. Danh mục nghiê ̣m thức khảo sát nồng độ bản mẫu

Nghiê ̣m thƣ́c

f-Primer

As-PCR Chƣ́ng dƣơng Nghiê ̣m thƣ́c f-Primer As-PCR Chƣ́ng dƣơng

T5T Ka-f(T) pAmpT – nồng độ 105 T3T Ka-f(T) pAmpT – nồng độ 103 C5T Ka-f(T) pAmpC – nồng độ 105 C3T Ka-f(T) pAmpC – nồng độ 103 T5C Ka-f(C) pAmpT – nồng độ 105 T3C Ka-f(C) pAmpT – nồng độ 103 C5C Ka-f(C) pAmpC – nồng độ 105 C3C Ka-f(C) pAmpC – nồng độ 103

Tám nghiệm thức trên nhằm khảo sát khả năng xác đi ̣nh SNP LCT -13910 của primer Kambara khi giảm nổng đô ̣ bản mẫu 100 lần. Nghiê ̣m thức T5T và C5C là hai nghiê ̣m thức bắt că ̣p đúng , nồng đô ̣ bản mẫu 105 bản sao / µl. Nghiê ̣m thức T3T và C 3C là hai nghiê ̣m thức bắt că ̣p đúng , nồng đô ̣ bản mẫu 103 bản sao/ µl, đươ ̣c kỳ vo ̣ng có giá tri ̣ Ct nhỏ hơn 6,64 Ct so với T5T và C3C. Nghiê ̣m thức T5C và C 5T là hai nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai , nồng đô ̣ bản mẫu 105 bản sao / µl. Nghiê ̣m thức T 3C và C 3T là hai nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai , nồng đô ̣ bản mẫu 103

bản sao/ µl, đươ ̣c kỳ vo ̣ng có giá tri ̣ Ct không xác đi ̣nh hoă ̣c gần Ct 35.

Kết quả thí nghiê ̣m được thể hiê ̣n dưới da ̣ng giá tri ̣ Ct -MCM6 như trong bảng 2.7.

Bảng 2.7. Kết quả khảo sát nồng độ bản mẫu

Nghiê ̣m

thƣ́c Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình

T5T 20,50 20,34 20,94 20,47 20,56 ± 0,26

T3T 27,86 28,01 26,78 27,03 27,42 ± 0,61

C5T 29,03 29,19 29,24 30,27 29,43 ± 0,57

C3T 34,64 N/A N/A N/A N/A

C5C 21,36 21,43 21,58 21,21 21,40 ± 0,15

C3C 27,54 27,69 28,00 28,26 27,87 ± 0,32

T5C 30,44 30,54 30,25 30,28 30,38 ± 0,14

T3C N/A N/A N/A N/A N/A

Trong đó: N/A là giá tri ̣ Ct không xác đi ̣nh được, tức lớn hơn 35 Ct.

Kết quả trên cho thấy , khi giảm nồng đô ̣ bản mẫu 100 lần, giá trị Ct của các nghiê ̣m thức bắt că ̣p đúng giảm phù hợp quy luật , chênh lê ̣ch giá tri ̣ Ct giữa hai nghiê ̣m thức trước và sau giảm nồng đô ̣ bản mẫu là từ 6,48 đến 6,86 Ct. Giá trị Ct của các nghiê ̣m thức bắt că ̣p sai sau khi giảm nồng đô ̣ bản mẫu (C3T và T3C) hầu như không xác đi ̣nh.

Nồng đô ̣ chứng dương 105

bản sao / µl đươ ̣c sử du ̣ng để thể hiê ̣n gần chính xác nồng đô ̣ bản sao MCM 6 trong di ̣ch DNA ly giải . Như vâ ̣y, để giảm nồng độ bản

59

mẫu 100 lần trước khi cho vào ống phản ứng , chúng tôi bổ sung bước pha loãng 100 lần dịch DNA ly giải vào quy trình thực hiện cuối cùng.

Quy trình real-time As-PCR dùng để xác đi ̣nh SNP LCT-13910

Thu 3 ml máu vào ống nắp xanh. Để lắng và thu lấy 200 µl bạch cầu. Bổ sung 1000 l dung dịch RBC 1X. Vortex mạnh. Ủ 10 phút ở 4-8o

C. Sau đó ly tâm eppendorf 2.500 rpm trong 1 phút rồi hút bỏ phần dịch nổi.

Bở sung 250 µl dung dịch Trizol, 35 µl dung dịch SDS 10%, 10 µl dung dịch proteinase K 10 mg/ml. Vortex mạnh cho tan cặn. Ủ 30 phút tại 70oC.

Bổ sung 350 µl dung dịch isopropanol. Vortex ma ̣nh . Chuyển toàn bộ hỗn hợp sang cột có đánh dấu tương ứng với mẫu. Sau đó ly tâm 8.000 rpm trong 10 phút rồi đổ bỏ dịch lọc.

Bổ sung vào cột silica 700 µl dung dịch guanidine hydrochloride – ethanol. Sau đó ly tâm 8.000 rpm trong 10 phút rồi đổ bỏ dịch lọc.

Bổ sung vào cột silica 700 µl dung dịch ethanol 70. Sau đó ly tâm 8.000 rpm trong 10 phút rồi đổ bỏ dịch lọc. Sau đó tiếp tu ̣c ly tâm 13.000 rpm trong 20 phút rồi chuyển cột sang các eppendorf 1,5 ml mới.

Bổ sung vào cột silica 50 µl dung dịch TE. Ủ 70 oC trong 20 phút. Sau đó ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút rồi thu eppendorf chứa dịch DNA ly giải.

Pha loãng di ̣ch DNA ly giải bằng cách hút 0,5 µl di ̣ch vào 45,5 µl TE.

Chuẩn bi ̣ mix T - Lac-AsPCR (1X AptaTaq DNA Master Optimization Kit, 0,2 mM primer IC (xuôi và ngươ ̣c ), 0,1 mM probe IC, 0,2 mM Ka-f(T), 0,2 mM Lac3r, 0,1 mM probe LCT -As, 5 µl bản mẫu , nước cất vừa đủ 25 µl) và mix C - Lac-AsPCR (1X AptaTaq DNA Master Optimization Kit, 0,2 mM primer IC (xuôi và ngươ ̣c ), 0,1 mM probe IC, 0,2 mM Ka-f(C), 0,2 mM Lac3r, 0,1 mM probe LCT-As, 5 µl bản mẫu, nước cất vừa đủ 25 µl).

Hút 5 µl di ̣ch DNA ly giải đã pha loãng vào mỗi mix T và mix C . Đồng thời thực hiê ̣n thêm 1 că ̣p mix chứng âm (dùng TE thay di ̣ch DNA ) và 1 că ̣p mix chứng dương (dùng chứng dương tương ứng thay dịch DNA ). Chạy chương trình luân nhiê ̣t Lac-AsPCR: 1 chu kỳ 95oC - 15 phút, 35 chu kỳ (95oC - 20 giây, 60oC - 40 giây, 72oC - 30 giây, đọc màu HEX và FAM).

Phân tích kết quả:

Xét cặp mix chứng âm, giá trị Ct màu FAM phải không xác định. Xét cặp mix chứng dương, giá trị Ct màu FAM phải xác định.

Xét cặp mix cần xác định SNP LCT -13910, giá trị Ct màu HEX phải xác định . Đồng thời:

 Trường hợp chỉ có mix T cho giá trị Ct màu FAM xác định , mẫu có kiểu

SNP LCT-13910 TT.

 Trường hợp chỉ có mix C cho giá tri ̣ Ct màu FAM xác đi ̣nh , mẫu có kiểu SNP LCT-13910 CC.

 Trường hợp hai mix T và mix C cho giá tri ̣ Ct màu FAM xá c đi ̣nh, mẫu có

60