Phƣơng pháp nghiên cứu

I. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU A Mục tiêu tổng quát.

3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phương pháp thiết kế primer và probe

Các primer và probe RFLP và As PCR đươ ̣c thiết kế dựa vào các bài báo khoa học. Sơ đồ vị trí primer và probe bắt cặp trên MCM 6 đươ ̣c thể hiê ̣n trong hình 2,2.

Hình 2.2.Vị trí primer và probe trên gene MCM6

Trình tự thiết kế được tiến hành theo các bước sau:

1. Tải trình tự MCM6 của người đã được công bố từ cơ sở dữ liệu NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/). 2. Thiết kế các primer.

3. Dùng phần mềm AlleleID 7.0 xác định chiều dài primer phù hợp với các yêu cầu cho primer (% GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc thứ cấp,…)

4. Kiểm tra lại sự đặc hiệu của primer bằng công cụ Basic Local Alignment Search Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).

5. Sau đó dùng phần mềm AlleleID 7.0 để tìm probe phù hợp yêu cầu (% GC, nhiệt độ nóng chảy, cấu trú c thứ cấp,…).

6. Xác định độ đặc hiệu trên NCBI

Phương pháp tách chiết DNA từ máu toàn phần

Xét nghiệm xác định SNP LCT-13910 sử du ̣ng bản mẫu là DNA bô ̣ gene . Hầu hết tế bào trong cơ thể đều có chứa DNA bô ̣ gene , trong đó DNA từ tế bào ba ̣ch

f-LCT- RFLP r-LCT- RFLP Probe LCT-As SNP LCT- 13910 Lac3f fPrimer As PCR Lac3r

45

cầu là mô ̣t trong những nguồn mẫu dễ thu nhâ ̣n. Khi để máu toàn phần lắng tự nhiên, máu toàn phần sẽ phân làm 3 lớ p chính là lớp huyết tương ở phía trên và lớp hồng cầu phía dưới, giữa 2 lớp này là lớp ba ̣ch cầu và tiểu cầu (hình 2.3).

Hình 2.3. Cấu trú c máu toàn phần

Máu toàn phần được thu nhâ ̣n và cho vào ống nắp xanh chứa chất chống đông là EDTA và để lắng tự nhiên trong 2-3 giờ đến khi phân thành 3 lớp. Sau đó, 200 l phần tế bào bạch cầu được thu nhâ ̣n (lớp giữa lớp hồng cầu và huyết tương). Sau khi tách lấy ba ̣ch cầu, dịch bạch cầu được tách DNA.

Phương pháp tách chiết tủa

Nguyên tắc tách chiết tủa là thu hổi DNA bằng tủa với cồn . Đầu ti ên, màng bi ̣ phá b ằng dung dịch TriZol có chứa phenol pH8, guanidine isothiocyanate, β- mercaptopethanol. Các hóa chất trên có vai trị chính trong vi ệc phá vỡ cấu trúc protein của màng tế bào và màng nhân tế bào ngư ời. Ngồi ra, hoạt động biến tính protein của các chất này cũng làm bất hoạt các enzyme phân hủy DNA (DNase) có trong hỗn hợp. DNA sau khi được giải phóng sẽ di chuyển vào pha nước. Chloroform được bổ sung vào hỗn hợp nhằm thu hút hoàn toàn phenol ra khỏi pha nước và giúp sự phân tách giữa pha nước và pha hữu cơ (phenol- chloroform) trở nên rõ ràng hơn. DNA trong pha nước sau đó được chuyển sang trạng thái không tan bằng isopropanol. Các gốc isopropanol và muối được loại bỏ ra khỏi tủa DNA bằng ethanol 70%. Dung dịch này đảm bảo việc làm sạch DNA và giữ DNA ở trạng thái không tan. Cuối cùng, tủa DNA được hòa tan trong dung dịch TE trước khi sử dụng cho phản ứng PCR.

Quy trình

1. Bổ sung 1000 l dung dịch RBC 1X vào mỗi eppendorf (chứa 200 µl bạch cầu). Vortex mạnh. Ủ 30 phút ở 4-8oC.

2. Ly tâm eppendorf 2.500 rpm trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch nổi.

3. Bổ sung 1000 l ung dịch Trizol. Vortex mạnh cho tan cặn. Ủ 20 phút ở

nhiê ̣t đô ̣ phòng.

4. Bổ sung 300 l chloroform, Vortex mạnh.

5. Ly tâm 12.000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ phịng. Chuyển toàn bơ ̣ dịch nổi sang các eppendorf 1,5 ml mới.

6. Bổ sung mô ̣t lượng isopropanol với thể tích tương đương thể tích di ̣ch nổi. Vortex nhẹ để trộn đều. Ủ 30 phút ở 4-8oC.

46

7. Ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ phần dịch nổi. 8. Bổ sung 1200 l ethanol 70.

9. Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ phần dịch nổi. 10. Ủ khô cặn trong 20 phút ở 70C trong bồn ủ nhiệt khô.

11. Huyền phù cặn trong 50 l TE. Thu eppendorf chứa dịch DNA ly giải. Sản phẩm DNA ly giải được chạy phả n ứng real-time PCR với mix IC-qPCR (1X AptaTaq DNA Master Optimization Kit, 0,2 mM primer IC (xuôi và ngươ ̣c), 0,1 mM probe IC, 5 µl bản mẫu, nước cất vừa đủ 25 µl). Chương trình luân nhiê ̣t IC là 1 chu kỳ 95o

C - 15 phút, 35 chu kỳ (95oC - 20 giây, 60oC - 40 giây, 72oC - 30 giây, đọc màu HEX ). Kết quả được thể hiê ̣n dưới da ̣ng giá tri ̣ Ct của IC (Ct-IC, màu HEX).

Phương pháp tách chiết cột

Nguyên tắc tách chiết cô ̣t dựa trên thu hồi DNA dựa vào sự liên kết của nucleic với ha ̣t silica trong cô ̣t . Đầu tiên , màng tế bào bị phá bẳng sử du ̣ng hỗn hợp guanidine HCl – Sodium dodecyl sµlfate (SDS). Các hóa chất trên có vai trỏ tương tự Trizol trong viê ̣c phá vỡ màng và ức chế DNase . SDS là mô ̣t hợp chất hoạt động bề mặt anion mạnh , mô ̣t mă ̣t phá vỡ màng tế bào , làm duỗi mạch DNA, mặt khác có khả năng liên kết , bắt giữ nhân heme – Fe2+ (có khả năng ức chế phản ứng PCR) có trong hồng cầu còn sót lại trong dịch tế bào . Sau đó, dịch DNA đươ ̣c cho phản ứng với isopropanol nhằm tăng khả năng bắt giữ DNA trên giá thể rắn (màng silica nh ồi trong cột). Dịch DNA sau xử lý đư ợc ly tâm qua màng silica. DNA liên kết hạt silica trong cột và các tạp chất, protein và polysaccharides trôi qua. DNA được làm sa ̣ch khỏi p rotein còn lại, muối hoă ̣c các sắc tố như nhân heme bằng nhiều lần sửa . Hai bước rửa tiếp theo nhằm đ ể loại bỏ các tạp chất. Bướ c rửa đầu tiên bằng guanidine hydrochloride – ethanol nồng đô ̣ thấ p để loại bỏ các protein và sắc tố . Bước rửa thứ hai bằng ethanol 70 để loại bỏ các muối. Cuối cùng DNA gắn trong cột được thu hồi bằng cách dung giải với dung dịch đệm TE (Tris-EDTA).

Quy trình

1. Bổ sung 1000 l dung dịch RBC 1X vào mỗi eppendorf (đang chứa 200

µl bạch cầu). Vortex mạnh. Ủ 10 phút ở 4-8oC.

2. Ly tâm eppendorf 2.500 rpm trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch nổi.

3. Bở sung 250 µl dung dịch Trizol, 35 µl dung dịch SDS 10%, 10 µl dung dịch proteinase K 10 mg/ml. Vortex mạnh cho tan cặn. Ủ 30 phút tại 70oC.

4. Bở sung 350 µl dung dịch isopropanol. Vortex mạnh. Chuyển toàn bộ hỗn hợp sang cột có đánh dấu tương ứng với mẫu.

5. Ly tâm 8.000 rpm trong 10 phút. Đổ bỏ dịch lọc.

6. Bổ sung vào cột silica 700 µl dung dịch guanidine hydrochloride – ethanol.

7. Ly tâm 8.000 rpm trong 10 phút. Đổ bỏ dịch lọc. 8. Bổ sung vào cột silica 700 µl dung dịch ethanol 70. 9. Ly tâm 8.000 rpm trong 10 phút. Đổ bỏ dịch lọc.

10. Ly tâm 13.000 rpm trong 20 phút để loại bỏ hết dấu vết ethanol 70. Chuyển cột sang các eppendorf 1,5 ml mới.

47

11. Bở sung vào cột silica 50 µl dung dịch TE. Ủ 70 o

C trong 20 phút.

12. Ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút. Thu eppendorf chứa dịch DNA ly giải

Phương pháp tạo dòng

Tạo dòng nhằm mục đích tạo chứng dương cho các thí nghiệm về sau . Nguyên tắc ta ̣o dịng là chuyển mơ ̣t trình tự mục tiêu vào plasmid . Sau đó, plasmid được biến na ̣p plasmid vào vi khuẩn . Nuôi vi khuẩn trong môi trường cho ̣n lo ̣c . Những vi khuẩn mang plasmid (plasmid tái tổ hợp và plasmid thuần ) sẽ mọc trên mơi trường cho ̣n lo ̣c này . Dịng vi khuẩn mang plamid tái tổ hợp được sàng lo ̣c bằng phương pháp PCR với hê ̣ mồi đă ̣c hiê ̣u cho trình tự mu ̣c tiêu . Chọn và tăng sinh khuẩn la ̣c cho ̣n lo ̣c thành dòng.

Các trình tự amplicon tương ứng với từng SNP được nhân bản và tạo dòng trong vector là pBluescript II SK (+) với chủng vi khuẩn chủ là E. coli DH5α (hình

2.4).

Hình 2.4. Sơ đồ tạo dịng AmpT và AmpC làm chứng dương

1. pBluescript II SK (+) được xử lý với enzyme SmaI để tạo đầu bằng (1X

Buffer J, 1X BSA, 1U Sma I, 2 µg pBluescript, nướ c cất vừa đủ 30 µl). Sau đó, hỡn hơ ̣p phản ứng cắt được ủ 4 giờ ở 25o

C.

2. Các sản phẩm thủy giải được tinh sạch bằng phenol:chloroform và tủa lại với ethanol tuyệt đối.

* Quy trình tinh sạch sản phẩm cắt

Bổ sung một thể tích phenol: cloroform (1:1), vortex đều. Ly tâm 13000 rpm trong 10 phút, thu dịch nổi.

Bổ sung 200 µl cloroform. Vortex mạnh cho đến khi thấy trắng đục. Ly tâm 13000 rpm trong 10 phút, thu dịch nổi.

Bổ sung 1/10 thể tích dung dịch natri acetate 3M - pH 5,2, hai thể tích ethanol tuyệt đối. Ủ 2 giờ ở -200C. Ly tâm 13000 rpm trong 10 phút, thu tủa.

Bổ sung 1 ml ethanol 70% để rửa tủa. Ly tâm 13000 rpm trong 5 phút. Ủ khô că ̣n. Huyền phù că ̣n trong 20 µl TE 1X.

3. pBluescript II SK (+) đã xử lý ở bước 1 và sản phẩm PCR được xử lý với enzyme ligase để thực hiện phản ứng nối (1X Buffer, 3U T4 ligase, 1 µg pBluescript đã xử lý , 3 µl sản phẩm PCR, nước cất vừa đủ 10 µl). Ủ 18 giờ ở 180C. Trình tự Amplicon pBluescript Sma I Sma I pBlue tái tổ hợp AmpT Amp T AmpC pBlue tái tổ hợp AmpC

48

4. Tạo tế bào khả nạp (để gây nh ững xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập vào tế bào E.coli dễ dàng hơn) bằng cách hoa ̣t hóa chủng E.coli

DH5α trong môi trườ ng LB. Sau đó ủ trong CaCl2.

* Quy trình tạo tế bào khả nạp

Cấy chuyền các tế bào E. coli DH5α từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB. Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC.

Cấy 500 µl dịch ni cấy trên vào 50 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37oC trong 2 giờ đến khi đạt giá trị OD600 từ 0,3-0,6.

Ly tâm thu sinh khối tế bào ở vận tốc 5000 rpm. Ủ 5 phút ở 4-8oC.

Huyền phù sinh khối trong 25 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ 30 phút ở 4- 8oC.

Ly tâm la ̣nh thu sinh khối tế bào với vận tốc 5000 rpm trong 5 phút.

Huyền phù nhẹ sinh khối tế bào trong 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM. Giữ tế bào khả nạp trên đá nhằm chuẩn bị cho bước biến nạp.

5. Biến nạp các plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α khả nạp. Sau đó đem trải dịch khuẩn lạc trên môi trường thạch LB-Ampicillin.

* Quy trình biến nạp

Bở sung 100 µl tế bào khả nạp vào ống chứa sản phẩm phản ứng nối. Ủ 30 phút ở 4-8oC.

Sốc nhiệt: 90 giây ở 42oC, 2 phút ở 4oC.

Bổ sung 900 µl mơi trườ ng LB và ni ủ hoạt hóa trong 1 giờ. Ly tâm thu sinh khối ở vận tốc 10.000 rpm trong 1 phút.

Cô đặc và trãi hết dịch vi khuẩn trên đĩa môi trường LB-Ampicillin, nuôi cấy 16 giờ ở 37oC.

6. Sàng lọc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với mix giải trình tự . Chọn khuẩn lạc cho tín hiệu dương tính và giải trình tự.

7. Dòng khuẩn lạc có kết quả giải trình tự mong muốn được ni giữ chủng trong môi trường LB.

8. Lấy mô ̣t ít di ̣ch tăng sinh , tách chiết plasmid làm chứng dương và bảo quản dưới dạng DNA trong -20oC.

Plasmid tách chiết từ dòng khuẩn la ̣c mang trình tự AmpT được ký hiệu là pAmpT. Plasmid tách chiết từ dòng khuẩn la ̣c mang trình tự AmpC được ký hiê ̣u là pAmpC.

Phương pháp PCR-RFLP

Dựa trên khuyến cáo trong nghiên cứu xác đi ̣nh SNP LCT -13910 bằng phương pháp PCR-RFLP (Kuchay 2011, Mendoza 2010), chúng tơi xây dựng quy trình

PCR-RFLP nhằm làm đới chứng với quy trình real -time As-PCR trong xác đi ̣nh SNP LCT-13910.

Hai chứng dương pAmpT và pAmpC được sử du ̣ng làm bản mẫu, chạy PCR trên mix Lac-PCR-RFLP (1X DnaFreeTM 2X Mµltiplex PCR Smart Mix, 0.2 mM primer LCT-RFLP (mồi xuôi và ngươ ̣c ), 5 µl bản mẫu , nước cất vừa đủ 25 µl).

49

Chương trình luân nhiê ̣t Lac-PCR-RFLP: 1 chu kỳ 95oC - 5 phút, 40 chu kỳ (95oC - 30 giây, 58oC - 30 giây, 72oC - 30 giây), 1 chu kỳ 72oC - 5 phút.

Sản phẩ m Lac-PCR-RFLP đươ ̣c na ̣p vào mix RFLP -Lactase (1X Buffer, 1X BSA, 5U Hinf I, 10µl sản phẩm Lac-PCR-RFLP, nướ c cất vừa đủ 25 µl). Ủ 3 giờ ở 37oC. Điện di sản phẩm RFLP-Lactase sau khi ủ trên gel agarose 5%.

Phương pháp real-time As-PCR

Phương pháp real -time As-PCR được sử du ̣ng trong nghiên cứu này là phương pháp kết hợp những cải tiến của phương pháp As -PCR (cho phép gia tăng đô ̣ đă ̣c hiê ̣u trong viê ̣c xác đi ̣nh SNP ) với những ưu điểm về đô ̣ nha ̣y , tránh nguy cơ ngoại nhiễm của phương pháp real-time PCR bằng mẫu dò TaqMan.

Mỗi bản mẫu được thực hiê ̣n phản ứng PCR trong 2 ống phản ứng, mô ̣t ống phản ứng chứa primer As -PCR có trình tự đầu 3’ là nucleotide T (gọi tắt là mix T ) nhằm xác đ ịnh SNP LCT -13910T, ống phản ứng kia chứa primer As -PCR có trình tự đầu 3’ là nucleotide C (gọi tắt là mix C ) nhằm xác đi ̣nh SNP LCT - 13910C. Trong ống bắt cặp đúng (ví dụ mix T được bổ sung mẫu có SNP LCT- 13910T), phản ứng PCR di ễn ra . Bình thường , huỳnh quang từ reporter bị quencher hấp thu ̣ . Trong giai đoa ̣n kéo dài , Taq polymerase thủy phân probe (đang bắt cặp trên DNA mu ̣c tiêu) bằng hoa ̣t tính 5’-3’exonuclease. Reporter tách khỏi probe và tách xa quencher. Huỳnh quang phát ra và được ghi nhận . Trong ống bắt cặp sai (ví dụ mix T được bổ sung mẫu khơng có SNP LCT-13910T), phản ứng PCR không diễn ra , probe không bi ̣ phân cắt nên không có tín hiê ̣u huỳnh quang nào được ghi nhận (hình 2.5)

Hình 2.5 Nguyên tắc kỹ thuật real-time As PCR

Trường hợp nồng đô ̣ bản mẫu cao , hiê ̣n tượng dương tính giả vẫn có khả năng sảy ra. Tuy nhiên, hiê ̣u suất PCR trong trường hợp này thấp hơn nhiều lần so với trường hợp bắt că ̣p đúng nên có thể phân biê ̣t được (Biosyn 2010, Campbell 2012, Intharanut 2013, Kugelman 2009). Một phần của hiê ̣n tượng dương giả là do hoa ̣t đô ̣ng nhân bản không chính xác của Taq-polymarse sau chu kỳ thứ 35. Vì vâ ̣y, nhiều cơng trình (sử dụng phương pháp As -PCR cải tiến) đã cài đă ̣t chương trình luân nhiệt trong 35 chu kỳ (Campbell 2012, Hirotsu 2010, Huang 2006, Intharanut 2013).

Đối với thí nghiệm trong luận văn này , chúng tôi sử dụng hai chứ ng dương pAmpT và pAmpC được sử du ̣ng làm bản mẫu , chạy real -time PCR trên mix Lac-AsPCR (1X AptaTaq DNA Master Optimization Kit, 0,2 mM primer IC (xuôi và ngươ ̣c), 0,1 mM probe IC, 0,2 mM mồi xuôi f-Primer As-PCR, 0,2 mM Lac3r, 0,1 mM probe LCT -As, 5 µl bản mẫu , nước cất vừa đủ 25 µl). Chương trình ln nhiê ̣t Lac-AsPCR: 1 chu kỳ 95oC - 15 phút, 35 chu kỳ (95oC - 20 giây,

50

nhiê ̣t đô ̣ lai - 40 giây, 72o

C - 30 giây, đọc màu HEX và FAM ). Kết quả thể hiê ̣n dưới da ̣ng giá tri ̣ Ct của MCM6 (Ct-MCM6, màu FAM).

Ngồi ra, chúng tơi sử dụng ba đối chứng khi thực hiê ̣n quy trình này

 Chứng dương (+): mẫu đã xác đi ̣nh có chứa DNA mu ̣c tiêu , thực hiê ̣n phản ứng trong cùng điều kiện với mẫu . Chứng (+) có kết quả dương tính chứng minh điều kiê ̣n, bô ̣ hóa chất thực hiê ̣n đa ̣t tiêu chuẩn chất lượng.

 Chứng âm (-): mẫu đã xác đi ̣nh không chứa DNA mu ̣c tiêu , được thực

hiê ̣n phản ứng trong cùng điều kiê ̣n với mẫu . Chứng (-) có kết quả âm tính chứng minh quá trình thực hiê ̣n không bi ̣ ngoa ̣i nhiễm.

 Chứng nô ̣i ta ̣i (internal control – IC): loại chứng dương đặc biệt , sử du ̣ng

hê ̣ primer - probe riêng (primer IC và probe IC được đánh dấu huỳnh quang màu HEX), được cho vào chung trong ống phản ứng , nhân bản và phát hiện một trình tự gene khác gene MCM6 trong bơ ̣ gene người. Q trình PCR đối với IC diễn ra đô ̣c lâ ̣p với gene MCM 6. Giá trị Ct- IC trong giới ha ̣n kỹ thuâ ̣t chứng minh quy trình thực hiện đúng kỹ thuật và mẫu không bị ức chế.

Sau đó, chúng tôi k hảo sát một số yếu tố để quy trình real -time As-PCR có thể xác định SNP như mong muốn.

Dựa theo giá tri ̣ Ct-MCM6 mà xác định mẫu chứa allele nào . Đối với mix T ,