CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Nguyên vật liệu
2.3.1 Mẫu hCG và kháng thể
Nguyên liệu chính cho các thí nghiệm trong luận văn này là hCG. Nguồn hCG cho các thí nghiệm đến từ ba nguồn là hCG tái tổ hợp, mẫu huyết thanh của phụ nữ đang mang thai và mẫu nước tiểu của phụ nữ đang mang thai.
Bảng 2. 1 Các kháng thể khảo sát
Tên Kí
hiệu Xuất xứ Mục đích
hCG beta-1 Monoclonal Antibody (INN-HCG-2)
β1-
mAb Invitrogen
Ba loại kháng thể chính được khảo sát trong đề tài hCG beta-2 Monoclonal Antibody
(INN-HCG-22)
β2-
mAb Invitrogen hCG beta-4 Monoclonal Antibody
(INN-HCG-24) β4- mAb Invitrogen Chorionic Gonadotropin Monoclonal Antibody (FB12) β9-
mAb Invitrogen Hai kháng thể khảo sát thêm
hCG beta core Monoclonal Antibody (INN-HCG-106)
β11-
mAb Invitrogen Goat anti-Mouse IgG (H+L)
Secondary Antibody, HRP
IgG-
HPR Invitrogen
Kháng thể thứ cấp hiện màu.
OPD Substrate Tablets (o- phenylenediamine dihydrochloride) OPD Thermo Fisher Chất nền cho horseradish peroxidase
2.3.3 Hóa chất dùng cho Western Blot
Bảng 2. 2 Hóa chất pha đệm tra mẫu
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma
Dung dịch đệm Laemmli dùng tra mẫu
(Laemmli 4X buffer/ loadingbuffer).
2-mercaptoethanol Sigma
Glycerol Sigma
Bromophenol blue Sigma
Tris-HCL Sigma
Bảng 2. 3 Hóa chất dùng pha đệm điện di
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma Dung dịch đệm đệm điện di (Running
buffer)
Glycine Sigma
Tris Base Sigma
Bảng 2. 4 Hóa chất dùng pha đệm chuyển màng
Bảng 2. 5 Hóa chất dùng pha đệm PBS
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Sigma
Dung dịch đệm Phosphate Buffered
Saline (PBS)
Sodium chloride (NaCl) Sigma
Monopotassium phosphate (KH2PO4) Sigma
Potassium chloride (KCL) Sigma
Nước (H2O) Sigma
Bảng 2. 6 Hóa chất dùng pha đệm Blocking
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Tris Base Sigma
Dung dịch blocking màng
Sodium chloride (NaCl) Sigma
Nước Sigma
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Methanol Sigma
Dung dịch đệm chuyển màng (Transfer buffer)
Glycine Sigma
2.3.4 Hóa chất dùng cho ELISA
Bảng 2. 7 Hóa chất dùng pha đệm phủ giếng
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma Dung dịch đệm phủ
giếng/ đệm carbonate (Coating buffer) 20X .
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma
Nước (H2O) Sigma
Bảng 2. 8 Hóa chất dùng pha đệm ủ kháng thể
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma
Dung dịch đệm ủ kháng thể (blocking buffer)
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma
Sodium azide (NaN3) Sigma
Bảng 2. 9 Hóa chất dùng pha đệm rửa giếng
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) Sigma
Dung dịch đệm Phosphate Buffered Saline (PBS).
Sodium chloride (NaCl) Sigma
Monopotassium phosphate (KH2PO4) Sigma
Potassium chloride (KCL) Sigma
Nước (H2O) Sigma
Bảng 2. 10 Hóa chất dùng pha đệm hiện màu
Tên Xuất xứ Mục đích sử dụng
Tris HCl Sigma
Đệm hiện màu pNPP
Sodium chloride (NaCl) Sigma
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma
Kháng thể sẽ được gắn nhãn ALP theo bộ kit Alkaline phosphatase Conjugation của hãng Abcam. Quy trình gắn nhãn ALP như sau:
Hình 2. 1 Quy trình gắn nhãn ALP cho kháng thể
Thêm 1µL thuốc thử Modifier vào mỗi 10µL kháng thể cần dán nhãn, trộn nhẹ. Mở nắp lọ AP Mix và dùng pipet lấy mẫu kháng thể (đã thêm thuốc thử Modifier)
trực tiếp vào vật liệu đông khô. Trộn lại nhẹ nhàng bằng cách rút và nhả lại dung dịch một hoặc hai lần bằng pipet.
Đậy nắp lọ lại và để yên trong 3 giờ trong bóng tối trong tủ ổn nhiệt ở 22oC. Theo khuyến cáo của hãng, cũng có thể ủ mẫu cũng có thể cài đặt và để qua đêm; thời gian ủ lâu hơn không ảnh hưởng tiêu cực đến kết quả.
Sau khi ủ trong 3 giờ (hoặc hơn), thêm 1µL thuốc thử Quencher cho mỗi 10µL kháng thể được sử dụng và trộn nhẹ nhàng. Các phức hợp có thể được sử dụng sau 30 phút mà không cần lọc lại.
Điều kiện nhiệt độ để lưu trữ được khuyến nghị ở 4°C cho bất kỳ phức hợp nào. Cần thêm chất bảo quản nếu muốn bảo quản các kháng thể đã dán nhãn lâu dài.
2.3.5 Hóa chất dùng cho thử nghiệm chế tạo que thử
Bảng 2. 11 Các hóa chất dùng cho thử nghiệm chế tạo que thử
Tên Cơng thức/kí
hiệu Xuất xứ Mục đích sử dụng
Human chorionic
gonadotropin HCG Sigma
Thử nghiệm khả năng tạo màu ở vị trí test line với hCG ở các nồng độ khác
nhau hCG beta-1 Monoclonal
Antibody (INN-HCG-2) β1- mAb Invitrogen hCG beta-4 Monoclonal
Antibody (INN-HCG-24) β4-mAb Invitrogen
Gold Conjugation Kit AuNPs Abcam Gắn nano vàng cho kháng thể β4-mAb
Hydrochloric acid HCl Điều chỉnh pH
Boric Acid H3BO3 Sigma
Pha đệm borate
Natri Hydroxit NaOH Sigma
Sucrose C12H22O11 Sigma Pha dung dịch xử lý
conjugate pad và sample pad
Tween 20 C58H114O26 Sigma
Sodium phosphate
dibasic Na2HPO4 Sigma
Pha đệm PBS Potassium phosphate
monobasic KH2PO4 Sigma
Potassium chloride KCl Sigma
Sodium chloride NaCl Sigma
BSA- Bovine Serum
Albumin BSA Sigma
Pha dung dịch blocking BSA 3%
Sodium Azide NaN3 Sigma Bảo quản dung dịch
blocking BSA 3% Sodium Dodecyl Sulfate SDS Sigma Pha dung dịch rửa màng
EMP Millipore Merck Làm conjugate pad
Cellulose fiber Sample
Pad Absorbant Merck
Tấm hút định hướng dòng chảy