Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 125 - Loại kháng thể: β1- mAb, β2- mAb, β4- mAb, β9- mAb, β11- mAb - Nồng độ hCG: 0, 1, 10 100, 1.000, 10.000 mIU/mL - Nồng độ kháng thể: 0, 100, 500, 1.000, 10.000, 20.000 ng/mL - Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL.
- Dung dịch khóa (blocking): BSA 3%.
- Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG-HRP với độ pha loãng 1/200
- Thêm cơ chất của HRP (OPD) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 490 nm
2.5.3.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha loãng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 1, 10 , 100, 1.000, 10.000 mIU/mL.
Các kháng thể đều có nồng độ gốc là 1.000.000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.3 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 500, 1.000, 10.000, 20.000 ng/mL.
Phủ giếng bằng kháng nguyên hCG với các nồng độ khác nhau
Khóa bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng thể với các nồng độ thử nghiệm vào các giếng
Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG-HRP với độ pha loãng 1/200
Thêm cơ chất của HRP (OPD) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 490 nm
Hình 2. 11 Tóm tắt quy trình khảo sát bằng
Đệm dùng rửa giếng (đệm PBS) khi thí nghiệm sẽ được pha lỗng về 1X Thí nghiệm tiến hành như sau:
- Gắn kháng nguyên lên các giếng: cho vào mỗi giếng 50 µL mẫu có chứa kháng nguyên. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu còn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể: cho vào mỗi giếng 100 µL kháng thể trong dung dịch đệm khóa (blocking buffer), ủ trong 1 giờ. Hút bỏ dung dịch trong giếng. Rửa mẫu bằng 200 µL PBS / giếng, rửa 3 - 5 lần.
- Ủ với kháng thể thứ cấp: tiến hành thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch kháng thể thứ cấp IgG-HRP pha trong dịch đệm khóa (blocking buffer, BSA 3%) với tỉ lệ pha loãng kháng thể thứ cấp là 1/200 từ dung dịch gốc có nồng độ 800 µg/mL. Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ kháng thể thứ cấp và rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/ giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 100 µL cơ chất tạo màu OPD, ủ trong 30 phút. Thêm vào mỗi giếng 100 µL H2SO4 2,5 M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 490 nM.
2.5.4 Khảo sát khả năng bắt cặp của kháng thể có gắn ALP
2.5.4.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 3 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG, nồng độ kháng thể, loại kháng
thể. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là ELISA trực tiếp.
Mục tiêu thí nghiệm: thí nghiệm này để gián tiếp xác nhận hiệu quả dán nhãn ALP
lên kháng thể và xác định nồng độ mAb – ALP phù hợp sử dụng trong phản ứng ELISA ở các thí nghiệm sau.
Bảng 2. 16 Thơng số thí nghiệm 3
Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú
40 - Nồng độ hCG: 0, 1, 10, 50, 100, 500, 1.000, 10.000 (mIU/ml). - Nồng độ kháng thể gắn ALP: 0, 100, 1.000, 2.000, 4.000 (ng/ml). - Loại kháng thể: mAb - β1- ALP, mAb - β2 - ALP, mAb - β4 - ALP.
- Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL. - Dung dịch blocking: BSA 3%. - Kháng thể đã được gắn sẵn Alkaline Phosphatase. Hiện màu bằng p-nitrophenyl phosphate. Dung dịch chuyển thành màu vàng. - Đo OD và so sánh 3 loại kháng thể với nhau.
2.5.4.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha loãng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 1, 10 , 100, 1.000, 10.000 mIU/mL.
Gắn ALP vào ba loại kháng thể β1- mAb, β2- mAb và β4- mAb (quy trình gắn nhãn ALP được trình bày trong phần 2.3.4). Các kháng thể đều có nồng độ gốc là 1.000.000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.3 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 1.000, 2.000, 4.000 (ng/ml).
Đệm dùng rửa giếng (đệm PBS) khi thí nghiệm sẽ được pha lỗng về 1X.
Phủ giếng bằng kháng nguyên (hCG) với các nồng độ khác nhau
Khóa bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng thể đơn dòng liên kết enzyme với độ pha loãng khác nhau
Thêm cơ chất của ALP (pNPP) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 405 nm
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Gắn kháng nguyên (hCG) lên các giếng: cho vào mỗi giếng 100 µL mẫu có chứa kháng thể. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu còn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể đơn dòng đã dán nhãn ALP (mAb-ALP): thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch mAb-ALP pha trong dung dịch đệm khóa (BSA 3%). Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ mAb-ALP và rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/lần/giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 200 µL cơ chất tạo màu pNPP, ủ trong 30 phút. Thêm vào mỗi giếng 50 µL NaOH 3M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm.
2.5.5 Khảo sát hiệu quả bắt cặp của kháng thể bắt giữ
2.5.5.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 4 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG, nồng độ kháng thể phủ giếng
(kháng thể bắt giữ), loại kháng thể phủ giếng. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là Sandwich ELISA.
Mục tiêu thí nghiệm: xác định được nồng độ kháng thể phủ giếng tối ưu nhất cho từng
loại kháng thể. Bảng 2. 17 Thơng số thí nghiệm 4 Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 48 - Nồng độ kháng thể phủ giếng: 0, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL - Nồng độ hCG: 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000 mIU/ml. - Nồng độ kháng thể phát hiện (mAb-ALP) cố định theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.4. - Cặp kháng thể sử dụng: β1- β2(ALP), β2 – β1(ALP), β4 – β2(ALP). - Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL. - Dung dịch blocking: BSA 3%. - Kháng thể đã được gắn sẵn Alkaline Phosphatase. Hiện màu bằng p-
nitrophenyl phosphate. Dung dịch chuyển thành màu vàng.
- Đo OD và so sánh 3 loại kháng thể với nhau.
2.5.5.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha loãng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10,000 mIU/ml.
Kháng thể phủ giếng đều có nồng độ gốc là 1.000,000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong bảng 2.8) ra thành các nồng độ 0, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL. Đệm dùng rửa giếng khi thí nghiệm sẽ được pha loãng về 1X.
Phủ giếng bằng kháng thể với các nồng độ khác nhau
Khóa bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng nguyên (hCG) với các nồng độ pha lỗng khác nhau
Thêm kháng thể đơn dịng có dán nhãn ALP
Thêm cơ chất của ALP (pNPP) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 405 nm
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Gắn kháng thể lên các giếng: cho vào mỗi giếng 100 µL mẫu có chứa kháng thể. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu cịn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với 50 mL kháng nguyên (hCG) được pha lỗng trong dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%) trong 1 giờ tại nhiệt độ phòng, hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể đơn dòng đã dán nhãn ALP (mAb-ALP): thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch mAb-ALP pha trong dung dịch đệm khóa (BSA 3%). Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ mAb-ALP và rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/lần/giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 200 µL cơ chất tạo màu pNPP, ủ trong 30 phút. Sau khi ủ, thêm vào mỗi giếng 50 µL NaOH 3M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm.
2.5.6 Kiểm tra tính khả thi của cặp kháng thể
2.5.6.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 4 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG, nồng độ kháng thể phát hiện
(kháng thể gắn ALP), loại kháng thể phát hiện. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là Sandwich ELISA.
Mục tiêu thí nghiệm: xác định tỷ lệ tối ưu của kháng thể phát hiện (kháng thể dán nhãn
ALP) và kháng nguyên. Bảng 2. 18 Thơng số thí nghiệm 5 Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 5 - Nồng độ hCG: 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000 mIU/mL. - Nồng độ kháng thể phát hiện (mAb - ALP): 0, 500, 100, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL. - Cặp kháng thể khảo sát: β1 - hCG- β2 - ALP, β1 – hCG - β4-ALP, β4 – hCG - β1 – ALP. - Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL. - Dung dịch blocking: BSA 3%.
- Kháng thể thứ 2 đã được gắn sẵn Alkaline Phosphatase. Hiện màu bằng p-nitrophenyl phosphate. Dung dịch chuyển thành màu vàng.
- Đo OD và so sánh các cặp kháng thể với nhau.
2.5.6.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha lỗng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000 mIU/ml.
Gắn ALP vào ba loại kháng thể β1- mAb, β2- mAb và β4- mAb (quy trình gắn nhãn ALP được trình bày trong phần 2.3.4). Nồng độ sẽ được pha theo dãy nồng độ 0, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL.
Phủ giếng bằng kháng thể với nồng độ cố định
Blocking bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng nguyên (hCG) với các nồng độ pha loãng khác nhau
Thêm kháng thể đơn dịng có dán nhãn ALP với các nồng độ pha loãng khác nhau
Thêm cơ chất của ALP (pNPP) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 405 nm
Hình 2. 14 tóm tắt quy trình khảo sát nồng độ kháng thể thứ 2 dán
Kháng thể phủ giếng đều có nồng độ gốc là 1.000,000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong bảng 2.8) theo nồng độ đã xác định trong thí nghiệm 2.5.5.
Đệm dùng rửa giếng khi thí nghiệm sẽ được pha lỗng về 1X. Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Gắn kháng thể lên các giếng: cho vào mỗi giếng 100 µL mẫu có chứa kháng thể. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu còn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với 50 mL kháng nguyên (hCG) được pha lỗng trong dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%) trong 1 giờ tại nhiệt độ phòng, hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể đơn dòng đã dán nhãn ALP (mAb-ALP): tiến hành thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch mAb-ALP pha trong dung dịch đệm khóa (BSA 3%). Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ mAb-ALP bằng cách rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/lần/giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 200 µL cơ chất tạo màu pNPP, ủ trong 30 phút. Sau khi ủ, thêm vào mỗi giếng 50 µL NaOH 3M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm.
2.5.7 Cố định các kháng thể lên màng Nitrocellulose bằng micropipette
2.5.7.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 5 được tiến hành với 1 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG (1.000, 2.000, 3.000,
4.000, 5.000 mIU/ml).
Mục tiêu thí nghiệm: kiểm tra khả năng cố định kháng thể lên màng Nitrocellulose. Thí
nghiệm 5 sẽ được thực hiện ở các nồng độ hCG khác nhau. Kết quả thí nghiệm chỉ cần trên que thử hiện màu là đạt yêu cầu.
2.5.7.2 Phương pháp tiến hành
a. Cấu tạo que thử LFA
Cấu tạo que thử LFA sẽ được thiết kế gồm các phần chính là: màng Nitrocellulos, đệm liên hợp (Conjugate pad), đệm chứa mẫu (Sample pad). Que thử sẽ được thiết kế theo dạng một que thử thai thơng thường như hình 2.15.
Hình 2. 15 Cấu tạo que thử LFA điển hình
b. Xử lý màng nitrocellulose
Kháng thể dùng cho vùng kiểm tra (test line) sẽ được pha loãng 4 lần trong đệm PBS 7.4 (kháng thể có nồng độ gốc 1 mg/ml). Kháng thể dùng để cố định lên vùng kiểm
soát (control line) sẽ được pha trong đệm PBS 7.4 (phần 3.2 Phụ lục A) theo tỉ lệ 1:7. Nồng độ kháng thể sẽ sử dụng nồng độ xác định ở các thí nghiệm trước. Vùng kiểm tra (test line) sẽ là mAb-β1, vùng kiểm soát (control line) là IgG.
Cắt màng nitrocellulose thành những que thẳng kích thước 20 mm× 3 mm. Tiến hành dùng micropipette nhỏ từng giọt vào màng nitrocellulose để tạo thành hai vùng kiểm tra (test line) và vùng kiểm soát (control line) như hình 2.16. Các màng
Nitrocellulose sẽ được ủ khô 1 tiếng trong tủ ấm 37oC.
Ngâm các que trong dung dịch đệm khóa màng (blocking buffer phần 3.5 Phụ lục A) trong thời gian 15 phút. Sau đó rửa các que thử này bằng dung dịch rửa màng (cơng thức trình bày trong phần 3.6 Phụ lục A) trong 15 phút. Ủ khô 1 tiếng trong tủ ấm ở 37oC là đã có thể sử dụng.
Hình 2. 16 vùng kiểm tra và vùng kiểm sốt trên màng Nitrocellulose
c. Xử lý đệm liên hợp (conjugate pad) và đệm chứa mẫu (sample pad)
Tiến hành gắn các hạt nano vàng lên mAb - β4 - ALP bằng Gold Conjugation Kit của hãng Abcam. EMP Millipore được sử dụng để làm đệm liên hợp (conjugate pad). Tiến hành nhỏ 10 µl lên các màng, ủ khơ 15 phút trong tủ ấm nhiệt độ 37oC.
Hình 2. 17 đệm liên hợp (conjugate pad) chứa kháng thể có gắn hạt nano vàng.
Cellulose fiber Sample Pad của hãng Merck sẽ được dùng làm phần đệm chứa mẫu (sample pad) có chức năng định hướng dịng chảy. Đệm chứa mẫu (sample pad) sẽ được xử lý trong dung dịch xử lý đệm chứa mẫu (sample pad) (phần 3.4 - Phụ lục A). d. Hoàn thành que thử
Sau khi đã xử lý các thành phần xong, tiến hành ghép các bộ phận lại để tạo thành một que thử LFA hồn chỉnh như hình 2.18. Que thử LFA bao gồm các thành phần sau: Đệm liên hợp (conjugate pad) đã cố định kháng thể mAb-AuNPs.
Đệm chứa mẫu (sample pad) đã được xử lý với kích thước 15 mm × 3 mm Màng nitrocellulose có chứa kháng thể với kích thước 20 mm× 3 mm.
e. Thử nghiệm với hCG
hCG tái tổ hợp sẽ được pha thành các nồng độ 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000 mIU/mL trong đệm PBS. Mỗi que thử sẽ được ngâm trong dung dịch hCG (2ml) trong 5 phút.
Hình 2. 19 Que thử được ngâm trong hCG
Sau đó cắt bỏ phần đi đệm chứa mẫu (sample pad), chuyển tồn bộ que thử sang một đĩa khác có chứa dung dịch đệm PBS (phần 3.2 - Phụ lục A), lúc này các kháng thể có gắn nano vàng sẽ chạy lên phía trên để tạo màu như hình 2.19, ngâm trong 5 phút