CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 Bố trí thí nghiệm
2.5.3 Khảo sát khả năng bắt cặp của các kháng thể
2.5.3.1 Bố trí nghiệm thức
Thí nghiệm 2 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: loại kháng thể, nồng độ kháng thể và nồng độ
hCG. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là ELISA gián tiếp
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát khả năng bắt cặp của các loại kháng thể và thu hẹp
khoảng nồng độ khảo sát. Ngoài 3 kháng thể chính, thí nghiệm này cịn tiến hành khảo sát thêm β9- mAb và β11- mAb.
Bảng 2. 15 Thơng số thí nghiệm 2 Số nghiệm Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 125 - Loại kháng thể: β1- mAb, β2- mAb, β4- mAb, β9- mAb, β11- mAb - Nồng độ hCG: 0, 1, 10 100, 1.000, 10.000 mIU/mL - Nồng độ kháng thể: 0, 100, 500, 1.000, 10.000, 20.000 ng/mL - Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL.
- Dung dịch khóa (blocking): BSA 3%.
- Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG-HRP với độ pha loãng 1/200
- Thêm cơ chất của HRP (OPD) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 490 nm
2.5.3.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha lỗng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 1, 10 , 100, 1.000, 10.000 mIU/mL.
Các kháng thể đều có nồng độ gốc là 1.000.000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.3 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 500, 1.000, 10.000, 20.000 ng/mL.
Phủ giếng bằng kháng nguyên hCG với các nồng độ khác nhau
Khóa bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng thể với các nồng độ thử nghiệm vào các giếng
Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG-HRP với độ pha loãng 1/200
Thêm cơ chất của HRP (OPD) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 490 nm
Hình 2. 11 Tóm tắt quy trình khảo sát bằng
Đệm dùng rửa giếng (đệm PBS) khi thí nghiệm sẽ được pha lỗng về 1X Thí nghiệm tiến hành như sau:
- Gắn kháng nguyên lên các giếng: cho vào mỗi giếng 50 µL mẫu có chứa kháng ngun. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu còn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể: cho vào mỗi giếng 100 µL kháng thể trong dung dịch đệm khóa (blocking buffer), ủ trong 1 giờ. Hút bỏ dung dịch trong giếng. Rửa mẫu bằng 200 µL PBS / giếng, rửa 3 - 5 lần.
- Ủ với kháng thể thứ cấp: tiến hành thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch kháng thể thứ cấp IgG-HRP pha trong dịch đệm khóa (blocking buffer, BSA 3%) với tỉ lệ pha lỗng kháng thể thứ cấp là 1/200 từ dung dịch gốc có nồng độ 800 µg/mL. Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ kháng thể thứ cấp và rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/ giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 100 µL cơ chất tạo màu OPD, ủ trong 30 phút. Thêm vào mỗi giếng 100 µL H2SO4 2,5 M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 490 nM.