CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 Bố trí thí nghiệm
2.5.6 Kiểm tra tính khả thi của cặp kháng thể
2.5.6.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 4 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG, nồng độ kháng thể phát hiện
(kháng thể gắn ALP), loại kháng thể phát hiện. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là Sandwich ELISA.
Mục tiêu thí nghiệm: xác định tỷ lệ tối ưu của kháng thể phát hiện (kháng thể dán nhãn
ALP) và kháng nguyên. Bảng 2. 18 Thơng số thí nghiệm 5 Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 5 - Nồng độ hCG: 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000 mIU/mL. - Nồng độ kháng thể phát hiện (mAb - ALP): 0, 500, 100, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL. - Cặp kháng thể khảo sát: β1 - hCG- β2 - ALP, β1 – hCG - β4-ALP, β4 – hCG - β1 – ALP. - Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL. - Dung dịch blocking: BSA 3%.
- Kháng thể thứ 2 đã được gắn sẵn Alkaline Phosphatase. Hiện màu bằng p-nitrophenyl phosphate. Dung dịch chuyển thành màu vàng.
- Đo OD và so sánh các cặp kháng thể với nhau.
2.5.6.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha loãng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000 mIU/ml.
Gắn ALP vào ba loại kháng thể β1- mAb, β2- mAb và β4- mAb (quy trình gắn nhãn ALP được trình bày trong phần 2.3.4). Nồng độ sẽ được pha theo dãy nồng độ 0, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL.
Phủ giếng bằng kháng thể với nồng độ cố định
Blocking bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng nguyên (hCG) với các nồng độ pha loãng khác nhau
Thêm kháng thể đơn dịng có dán nhãn ALP với các nồng độ pha loãng khác nhau
Thêm cơ chất của ALP (pNPP) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 405 nm
Hình 2. 14 tóm tắt quy trình khảo sát nồng độ kháng thể thứ 2 dán
Kháng thể phủ giếng đều có nồng độ gốc là 1.000,000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong bảng 2.8) theo nồng độ đã xác định trong thí nghiệm 2.5.5.
Đệm dùng rửa giếng khi thí nghiệm sẽ được pha lỗng về 1X. Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Gắn kháng thể lên các giếng: cho vào mỗi giếng 100 µL mẫu có chứa kháng thể. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu cịn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với 50 mL kháng nguyên (hCG) được pha lỗng trong dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%) trong 1 giờ tại nhiệt độ phòng, hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể đơn dòng đã dán nhãn ALP (mAb-ALP): tiến hành thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch mAb-ALP pha trong dung dịch đệm khóa (BSA 3%). Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ mAb-ALP bằng cách rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/lần/giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 200 µL cơ chất tạo màu pNPP, ủ trong 30 phút. Sau khi ủ, thêm vào mỗi giếng 50 µL NaOH 3M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm.