CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 Bố trí thí nghiệm
2.5.8 Cố định kháng thể lên màng bằng in phun nano
2.5.8.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 6 được tiến hành với 1 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG (1.000, 2.000, 4.000,
8.000, 10.000 mIU/ml).
Mục tiêu thí nghiệm: kiểm tra khả năng cố định kháng thể lên màng Nitrocellulose
bằng kỹ thuật in phun nano. Thí nghiệm 6 sẽ được thực hiện ở các nồng độ hCG khác nhau. Kết quả thí nghiệm chỉ cần trên que thử hiện màu là đạt yêu cầu. Sau đó sẽ dùng phần mềm ImageJ giúp đo cường độ màu và dựng đường chuẩn.
2.5.8.2 Phương pháp tiến hành
a. Xử lý đệm chứa mẫu và conjugate pad
Sử dụng màng sợi thủy tinh EDM Millipore để làm đệm chứa mẫu và đệm liên hợp. Đệm chứa mẫu được ngâm trong dung dịch xử lý đệm chứa mẫu và đệm liên hợp được ngâm trong dung dịch xử lý đệm liên hợp trong 1 giờ 30 phút ở nhiệt độ phịng, sau đó để khơ trong tủ sấy với nhiệt độ 37oC cho đến khi khơ hồn tồn.
b. Cố định kháng thể bắt giữ tại vị trí test line
Tương tự như quá trình tạo kênh dẫn trên màng Nitrocellulose, quá trình cố định kháng thể trên đế giấy cũng được thực hiện bằng phương pháp in phun áp điện bằng thiết bị in phun CeraDrop printer X. Xung điện các pha của máy in phun CeraDrop printer X là yếu tố quan trọng bậc nhất trong việc cố định các chất sinh học như BSA hay kháng thể lên đế giấy Nitrocellulose vì mức xung phù hợp sẽ quyết định độ ổn định trong việc đẩy mực ra khỏi đầu in (tránh tình trạng đầu vịi bị tắc do xung q yếu không thể đẩy mực ra hoặc giọt vệ tinh do tốc độ đẩy ra của giọt mực quá nhanh). Như đã được khảo sát ở một đề tài khác, mức xung điện được lựa chọn cho quy trình cố định kháng thể là - 1 V và 15 V dành cho đầu in DMC 11601 (thế tích trung bình 1 pL). Kháng thể β1- mAb được in lên kênh dẫn thẳng trên đế giấy với độ rộng 2 mm và số lớp in là 3 lớp (Hình
2.21). Sau khi cố định kháng thể lên đế giấy Nitrocellulose, que dẫn sẽ được ủ trong
vòng 1 tiếng nhằm tăng thời gian cố định kháng thể. Tiếp đến màng Nitrocellulose sẽ được ngâm trong dung dịch khóa màng trong 30 phút. Cuối cùng, que dẫn sẽ được ngâm trong dung dịch rửa màng trong thời gian 30 phút nhằm loại bỏ hết các protein không bám dính được trên màng.
Hình 2. 21 Thiết kế in kháng thể trên đế giấy
c. Cố định kháng thể phát hiện gắn nano vàng lên đệm liên hợp
- Kháng thể β4-mAb sau khi được gắn hạt nano vàng (AuNPs) theo hướng dẫn kèm theo bộ Gold Conjugation Kit (Abcam) được pha loãng trong dung dịch BSA 5% (bổ sung 0,1 % Tween 20 (v/v)) để có nồng độ là 250.000 ng/mL.
- Dùng pipet nhỏ lên mỗi đệm liên hợp (kích thước 10mm ì3 mm/ m liờn hp) 8àL kháng thể β4-mAb-AuNPs sau đó để khơ ở nhiệt độ phịng.
d. Phân tích màu
Tính năng Histogram của phần mềm ImageJ sẽ được ứng dụng cho việc đo cường độ màu của vùng kháng thể được phun lên đế giấy.
Khoảng nồng độ thử nghiệm từ 1.000 – 10.000 mIU/mL, giá trị màu tại mỗi nồng độ sẽ được thực hiện đo cuờng độ màu 3 lần sau đó giá trị trung bình của 3 lần đo sẽ được dùng để dựng đường tín hiệu chuẩn. Sau khi quét vùng màu ở vị trí test line trên đế giấy, kết quả Histogram sẽ trả về cường độ màu dạng hình xám (grayscale), cường độ RGB và cường độ riêng lẻ của 3 màu đỏ, xanh lam và xanh lá.
Thông số cường độ màu đỏ sẽ được sử dụng cho việc dựng đường chuẩn tín hiệu. Sau khi nhận được kết quả cường độ của màu đỏ tại vùng được quét, các thông số này sẽ được lưu lại cùng với mức độ sai số.