CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 Bố trí thí nghiệm
2.5.7 Cố định các kháng thể lên màng Nitrocellulose bằng micropipette
2.5.7.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 5 được tiến hành với 1 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG (1.000, 2.000, 3.000,
4.000, 5.000 mIU/ml).
Mục tiêu thí nghiệm: kiểm tra khả năng cố định kháng thể lên màng Nitrocellulose. Thí
nghiệm 5 sẽ được thực hiện ở các nồng độ hCG khác nhau. Kết quả thí nghiệm chỉ cần trên que thử hiện màu là đạt yêu cầu.
2.5.7.2 Phương pháp tiến hành
a. Cấu tạo que thử LFA
Cấu tạo que thử LFA sẽ được thiết kế gồm các phần chính là: màng Nitrocellulos, đệm liên hợp (Conjugate pad), đệm chứa mẫu (Sample pad). Que thử sẽ được thiết kế theo dạng một que thử thai thơng thường như hình 2.15.
Hình 2. 15 Cấu tạo que thử LFA điển hình
b. Xử lý màng nitrocellulose
Kháng thể dùng cho vùng kiểm tra (test line) sẽ được pha loãng 4 lần trong đệm PBS 7.4 (kháng thể có nồng độ gốc 1 mg/ml). Kháng thể dùng để cố định lên vùng kiểm
soát (control line) sẽ được pha trong đệm PBS 7.4 (phần 3.2 Phụ lục A) theo tỉ lệ 1:7. Nồng độ kháng thể sẽ sử dụng nồng độ xác định ở các thí nghiệm trước. Vùng kiểm tra (test line) sẽ là mAb-β1, vùng kiểm soát (control line) là IgG.
Cắt màng nitrocellulose thành những que thẳng kích thước 20 mm× 3 mm. Tiến hành dùng micropipette nhỏ từng giọt vào màng nitrocellulose để tạo thành hai vùng kiểm tra (test line) và vùng kiểm soát (control line) như hình 2.16. Các màng
Nitrocellulose sẽ được ủ khô 1 tiếng trong tủ ấm 37oC.
Ngâm các que trong dung dịch đệm khóa màng (blocking buffer phần 3.5 Phụ lục A) trong thời gian 15 phút. Sau đó rửa các que thử này bằng dung dịch rửa màng (cơng thức trình bày trong phần 3.6 Phụ lục A) trong 15 phút. Ủ khô 1 tiếng trong tủ ấm ở 37oC là đã có thể sử dụng.
Hình 2. 16 vùng kiểm tra và vùng kiểm soát trên màng Nitrocellulose
c. Xử lý đệm liên hợp (conjugate pad) và đệm chứa mẫu (sample pad)
Tiến hành gắn các hạt nano vàng lên mAb - β4 - ALP bằng Gold Conjugation Kit của hãng Abcam. EMP Millipore được sử dụng để làm đệm liên hợp (conjugate pad). Tiến hành nhỏ 10 µl lên các màng, ủ khơ 15 phút trong tủ ấm nhiệt độ 37oC.
Hình 2. 17 đệm liên hợp (conjugate pad) chứa kháng thể có gắn hạt nano vàng.
Cellulose fiber Sample Pad của hãng Merck sẽ được dùng làm phần đệm chứa mẫu (sample pad) có chức năng định hướng dịng chảy. Đệm chứa mẫu (sample pad) sẽ được xử lý trong dung dịch xử lý đệm chứa mẫu (sample pad) (phần 3.4 - Phụ lục A). d. Hoàn thành que thử
Sau khi đã xử lý các thành phần xong, tiến hành ghép các bộ phận lại để tạo thành một que thử LFA hồn chỉnh như hình 2.18. Que thử LFA bao gồm các thành phần sau: Đệm liên hợp (conjugate pad) đã cố định kháng thể mAb-AuNPs.
Đệm chứa mẫu (sample pad) đã được xử lý với kích thước 15 mm × 3 mm Màng nitrocellulose có chứa kháng thể với kích thước 20 mm× 3 mm.
e. Thử nghiệm với hCG
hCG tái tổ hợp sẽ được pha thành các nồng độ 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000 mIU/mL trong đệm PBS. Mỗi que thử sẽ được ngâm trong dung dịch hCG (2ml) trong 5 phút.
Hình 2. 19 Que thử được ngâm trong hCG
Sau đó cắt bỏ phần đi đệm chứa mẫu (sample pad), chuyển tồn bộ que thử sang một đĩa khác có chứa dung dịch đệm PBS (phần 3.2 - Phụ lục A), lúc này các kháng thể có gắn nano vàng sẽ chạy lên phía trên để tạo màu như hình 2.19, ngâm trong 5 phút sau đó để khơ tự nhiên.