S T T
Các Epitope Đặc trưng của kháng thể đơn dịng
Cod e mAb- Code Vị trí gắn trên kháng ngun hCG hCG β hCG βcF hCG n hCG βn -CTP hCG CTP hCGβ 1 β1 INN- hCG-2 Nút cystine hCGβ 10 +60 2 β2 INN- hCG- 22 hCGβ loop 1+3 hCGβ 20-25 +68-77 3 β4 INN- hCG- 24 4 β9 FB12 hCGβ 111-116 5 Β11 INN- hCG- 106 hCGβcf
1.4 Kỹ thuật Western Blot
1.4.1 Tổng quan phương pháp Western Blot
Western Blot đơi khi cịn được gọi với cái tên khác như immunoblot, là phương pháp phát hiện protein mong muốn bằng cơ chế kháng nguyên – kháng thể. Western Blot là một quy trình phức tạp gồm nhiều cơng đoạn như phải tách được protein mong muốn từ trong mẫu bằng kỹ thuật điện di protein, chuyển protein lên các màng lai có khả năng liên kết với protein và cuối cùng là phát hiện protein đích bằng kháng thể tương ứng với nó. Khả năng ứng dụng của Western Blot cũng rất rộng rãi và thường xuyên trong các lĩnh vực hóa sinh, sinh học và nhiều lĩnh vực khác.
Cái tên Western Blot lần đầu tiên xuất hiện là vào năm 1980, khi W. Neal Burnette và các cộng sự tiến hành quy trình đơn giản chuyển kháng nguyên của virus murine leukemia từ gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS) sang một tấm nitrocellulose và phát hiện ra bằng phản ứng miễn dịch với Staphylococcus protein A [47]. Tuy nhiên, thực chất phương pháp này đã được mô tả từ năm 1979 bởi Harry Towbin và các cộng sự khi họ mơ tả quy trình định lượng protein ribosome từ gel có chứa urea nhưng khi đó phương pháp này chưa được đặt tên [42]. Đã trải qua 4 thập kỷ, phương pháp Western Blot dần trở thành phương pháp phân tích phổ biến trên khắp thế giới, nhưng do quy trình rất nhiều công đoạn phức tạp nên kết quả cũng như thông số kỹ thuật là không nhất qn giữa các phịng thí nghiệm.
Phương pháp Western Blot là một phương pháp rất hữu ích cho các phịng thí nghiệm nhờ những yếu tố đặc thù. Ngoài chức năng xác định protein quan tâm trong một hỗn hợp phức tạp, nó cịn có thêm chức năng bán định lượng để xác định và so sánh sự biểu hiện của các protein cụ thể trong hỗn hợp các tế bào và mô khác nhau [23], phương pháp này thể hiện sự vượt trội ở chức năng xác định và bán định lượng protein nhưng lại rất hiếm khi được sử dụng như một cơng cụ để định lượng tuyệt đối vì những thơng số
khắt khe khi định lượng. Vì vậy, để định lượng protein thì có thể sử dụng phương pháp khác thay thế, Western Blot không thể hiện thế mạnh trong việc định lượng tuyệt đối.
Phương pháp Western Blot thể hiện sự vượt trội trong việc xác định và bán định lượng protein bởi vì độ nhay và độ đặc hiệu của phản ứng. Phương pháp này có thể phát hiện protein ở nồng độ rất thấp (ở mức picogram) trong mẫu [42]. Vì vậy nó có thể sử dụng để phát hiện, chẩn đoán sớm những dấu hiệu trong y học, điển hình phải kể đến như phát hiện hCG trong mang thai. Độ nhạy của phương pháp đến từ việc phân tách protein trên gel thơng qua kích thước, điện tích và cấu trúc bằng điện di. Độ đặc hiệu của phương pháp đến từ tính đặc hiệu của tương tác kháng nguyên – kháng thể, chỉ phân tách dựa vào các thơng số lý hóa thì đơi khi vẫn có thể xảy ra sai sót, nhưng chính nhờ tính chọn lọc của kháng thể đặc hiệu cho phép phát hiện protein trong mẫu có chứa rất nhiều protein khác nhau.
Phương pháp này cũng tương tự như những kỹ thuật khác, Western Blot vẫn có những hạn chế nhất định. Hạn chế đầu tiên cũng đến từ chính ưu điểm về độ đặc hiệu của nó. Phương pháp này chỉ có thể thực hiện được khi có sẵn kháng thể đặc hiệu nhận biết được protein quan tâm, điều đó có nghĩa rằng Western Blot không thể phát hiện được những protein mới chưa có kháng thể đặc hiệu được sản xuất bởi các cơng ty. Bên cạnh đó, kháng thể đặc hiệu được các cơng ty sản xuất hiện nay thì giá thành vẫn rất cao. Trên lý thuyết, những kháng thể thương mại có thể bắt đặc hiệu những protein đích, nhưng thực tế mỗi công ty sản xuất kháng thể đều cho ra một loại kháng thể với các thông số khác nhau. Vì vậy, việc lựa chọn kháng thể thật sự hữu ích cho nghiên cứu là việc hết sức quan trọng.
Quy trình thực hiện Western Blot rất nhiều giai đoạn và việc thực hiện sai lầm ở một cơng đoạn nhỏ trong quy trình cũng dẫn đến những kết quả khơng mong muốn. Chi phí đầu tư cho máy móc thiết bị cũng rất tốn kém và ở mỗi nghiên cứu.
1.4.2 Nguyên tắc kỹ thuật
1.4.2.1 Chuẩn bị mẫu
Sau khi thu nhận mẫu protein, mỗi mẫu đều cần phải được chuẩn hóa lượng protein trước khi đưa vào các giếng điện di. Việc định lượng protein có thể thực hiện bằng các phương pháp định lượng thủ công như phương pháp Bradford hoặc đo độ hấp thụ UV ở bước sóng 280nm, hoặc đối với những trường hợp lượng mẫu q ít thì có thể sử dụng các máy móc hiện đại như Nanodrop. Sau khi định lượng nồng độ, các mẫu sẽ được pha lỗng đến nồng độ thích hợp để chuẩn bị cho việc nạp mẫu.
Trước khi nạp mẫu, protein cần phải được xử lý một lần cuối cùng trước khi cho vào các giếng điện di. Protein cần phải được xử lý biến tính để mở ra các cấu trúc bậc hai hoặc bậc ba, để lộ ra trình tự amino acid chính, điều này sẽ làm cho trọng lượng phân tử của protein đúng nhất với dự đoán. Một loại đệm phổ biến nhất được sử dụng trong biến tính protein là đệm Laemmli [43] đây là đệm được phát triển từ chính tác giả Laemmli UK khi ơng tiến hành nghiên cứu protein của bacteriophage T4.
Cuối cùng, để protein có thể di chuyển trong dịng điện thì tất cả các nhóm R (nhóm amino acid chức năng) của protein cần phải được phủ điện tích âm bằng cách thêm vào SDS (sodium dodecyl sulfate). Thông thường, từ 10–100μg protein sẽ được nạp vào, nhưng con số cụ thể vẫn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độ dày của gel, độ rộng của các giếng, vì vậy, cần tinh chỉnh hợp lý lượng mẫu nạp vào các giếng. Chất chuẩn cần lựa chọn phù hợp, phải bao gồm cả kích thước của đoạn protein mong muốn. Chất chuẩn có hiện nhiều màu sẽ giúp dễ dàng theo dõi quá trình hơn.
1.4.2.2 Điện di trên gel polyacrylamide
Sau khi đã hoàn tất các bước chuẩn bị, protein sẽ được cho chạy trong gel Polyacrylamide (PAGE), các protein đã được biến tính sẽ được phân tách dựa trên trọng lượng phân tử của chúng. Các chuỗi polymer trong gel sẽ liên kết với nhau tạo thành
mạng lưới có các lỗ trống, nhiệm vụ của những lỗ trống này là cản trở sự di chuyển của protein trong gel, protein có trọng lượng phân tử càng lớn thì mức độ cản trở càng cao. Nguyên tắc điều chỉnh kích thước lỗ gel nhằm mục đích phân tách các protein này lần đầu được giới thiệu bởi Leonard Ornstein lần đầu tiên vào năm 1964 [24], ông gọi đây là phương pháp điện di đĩa (Disc Electrophoresis). Đây chính là nguyên tắc chung được dùng làm nền móng cho các phương pháp điện di sau này.
Gel polyacrylamide là gel thương mại đầu tiên được mô tả bởi Samuel Raymond vào năm 1959 [37]. Gel polyacrylamide được cấu tạo từ các đơn phân là 2 monomer- acrylamide và N,N1-methylenebisacrylamid liên kết chéo với nhau tạo thành các lỗ xốp có kích thước giống nhau, kích thước các lỗ này phụ thuộc vào số lượng liên kết chéo và nồng độ các đơn phân. Để thay đổi kích thước các lỗ xốp thì chỉ cần thay đổi nồng độ acrylamide, tùy từng loại protein cần phân tích mà lựa chọn nồng độ acrylamide thích hợp. Nồng độ gel cao thì kích thước lỗ xốp nhỏ, mức độ cản trở cao, thích hợp cho phân tích protein có trọng lượng phân tử thấp. Ngược lại, nồng độ gel thấp sẽ phù hợp với các protein có trọng lượng phân tử cao.
Ngồi gel polyacrylamide, người ta cịn có thể sử dụng gel thủ cơng như agarose, gel agarose thì thích hợp cho các protein có kích thước rất lớn. Gel polyacrylamide gặp khó khăn khi phân tách các protein có kích thước lớn hơn 500 kDa trong khi gel agarose có khả năng phân tách các gel có kích thước rất lớn (ví dụ như các isoform của titin có kích thước 700 – 4.200 kDa) [46].
Hệ thống điện di được thiết kế khơng mang tính liên tục, hệ thống này sẽ được thiết kế để tập trung các mẫu protein và cho phép phân tách protein. Gel polyacrylamide sẽ được thiết kế thành 2 phần xếp chồng lên nhau, phía trên sẽ là gel cơ đặc (stacking gel) và phần phía dưới sẽ là gel phân tách (resolving gel hay separate gel). Hai loại gel này sẽ có thành phần giống nhau nhưng lại khác nhau về những thông số nhất định.
Stacking gel sẽ có kích thước lỗ xốp lớn hơn resolving gel, pH của stacking gel là 6,8 trong khi resolving gel là 8,8.
Nguyên tắc hoạt động đầu tiên dựa trên sự khác biệt về kích thước lỗ xốp, các protein sẽ di chuyển từ stacking gel có kích thước lỗ xốp lớn cho đến resolving gel có kích thước lỗ xốp nhỏ hơn, do đó kích thước lỗ nhỏ hơn sẽ làm chậm quá trình di chuyển, khiến các protein xếp chồng lên nhau thành các dải nhỏ gọn.
Nguyên tắc thứ hai dựa Nguyên tắc thứ hai sử dụng sự di chuyển của cả ion và protein thông qua dung dịch đệm pH. Trong cả hai loại gel đều có sự hiện diện của chloride ion và glycinate ion. Ở stacking gel phía trên có pH 6.8 chloride ion sẽ di chuyển nhanh nhất, sau đó đến protein, glycinate ion bị giảm khả năng di chuyển do pH thấp.
Vì vậy tạo thành cấu trúc dạng sandwich với protein nằm giữa 2 loại ion, xếp thành các dải tập trung chặt chẽ. Khi đến resolving gel, pH lúc này là 8,8, glycinate ion sẽ khơng cịn bị hạn chế khả năng di chuyển, lúc này cả 2 loại ion đều chạy vượt lên trên protein làm cho protein khơng cịn bị trói buộc giữa 2 loại ion, từ đó phân tách protein khơng cịn bị cản trở [2].
1.4.2.3 Chuyển thẩm lên màng
Sau khi protein được phân tách thành các dải tách biệt nhau, chúng sẽ được chuyển từ gel sang một tấm màng khác. Màng này sẽ có ái lực cao với protein và sẽ cố định protein nằm trên màng, cho phép protein có thể tương tác với kháng thể và màng này cũng có độ bền cao hơn nhiều do với gel. Việc chuyển thẩm cũng dựa trên nguyên tắc tương tự điện di trên gel, protein tích điện âm sẽ chạy từ bản gel qua màng bằng một dịng điện. Sau khi hồn tất chuyển thẩm, trên bề mặt màng sẽ phản chiếu các protein đúng với vị trí trên gel. Hiện nay, các phịng thí nghiệm thường sử dụng 2 loại màng là màng polyvinylidene difluoride (PVDF) và màng nitrocellulose. Mỗi loại màng đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng.
Màng nitrocellulose xuất hiện từ khá lâu và rất dễ dàng sử dụng cho chuyển thẩm ướt hoặc chuyển thẩm bán khơ do tính chất dễ thấm nước của nó. Tuy nhiên, nó lại rất giịn khi khơ và các protein nhỏ có xu hướng di chuyển qua màng nitrocellulose và chỉ một phần nhỏ trong tổng số lượng thực sự liên kết, một nhược điểm nữa của màng nitrocellulose là nó khơng thể nhuộm bằng Coomassie brilliant blue (CBB) – một chất nhuộm màng phổ biến [21].
Màng PVDF có ưu điểm là có khả năng liên kết với protein cao, độ bền vật lý tốt và tương đối trơ nên cũng bền về mặt hóa học. Màng PVDF sau khi chuyển thẩm có thể được dùng cho nhiều mục đích như xác định trình tự đầu N, phân giải protein - phân tách peptide - giải trình tự bên trong cùng với phân tích Western Blot. Màng PVDF cịn có khả năng nhuộm màu với Coomassie brilliant blue.
Nhược điểm của màng PVDF là rất đắt tiền, sau khi kích hoạt thì phải dùng ngay, có khả năng liên kết mạnh với protein nhưng lại rất kén chọn hệ thống điện di trên gel, u cầu phải có hệ thống thích hợp [2]. Tương tác giữa màng và kháng thể có thể xảy ra dẫn đến hiện tượng màu nền trên màng nếu khơng rửa kỹ lưỡng. Do tính chất kỵ nước nên màng PVDF cần phải được ngâm trong methanol trước khi sử dụng, và cần lưu ý là việc truyền protein lên màng sẽ bị ức chế bởi nồng độ SDS q cao [34].
Q trình chuyển thẩm có rất nhiều thơng số cần lưu ý. Thời gian chuyển thẩm quá ngắn sẽ làm cho protein cịn sót lại nhiều trong gel, tín hiệu sẽ yếu hoặc khơng có tín hiệu. Ngược lại, nếu thời gian quá dài sẽ lôi kéo các protein chạy ra khỏi màng, cũng sẽ làm cho khơng có tín hiệu trên màng. Để kiểm tra hiệu quả của q trình chuyển thẩm có thể sử dụng nhuộm gel (ví dụ như Coomassie/Ponceau) như một phương thức kiểm tra protein cịn sót lại trên màng [2].
Thành phần đệm cũng là một yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình chuyển thẩm. Các thành phần cơ bản của đệm cũng là tris-base, glycine và ở pH 8.3 [42] nhưng lại cần lưu ý là không nên điều chỉnh pH bằng việc thêm vào acid hoặc base, nó sẽ làm
tăng hàm lượng ion trong dung dịch, độ dẫn điện sẽ cao hơn và tăng nhiệt độ của dung dịch. Kết quả là sẽ gây nhiễu nền hoặc chuyển thẩm khơng hiệu quả [2]. Tóm lại, nếu khơng chuyển protein lên màng một cách hiệu quả và đầy đủ thì việc định lượng và phân tích về sau sẽ khơng chính xác.
1.4.2.4 Khóa màng
Khóa màng (Blocking) là bước đơn giản nhất trong tồn bộ quy trình Western Blot, nó đóng vai trị phủ hết những vị trí cịn trống trên màng, ngăn cản sự gắn kết không đặc hiệu của kháng thể lên màng, điều này sẽ giúp cho giảm nền trong các bước tiếp theo [2]. Hiện nay, khóa màng (Blocking) thường sử dụng là sữa khơ khơng béo pha lỗng trong Tris Buffer Saline Tween-20 (TBST) và Bovine Serum Albumin (BSA; thường là 5%). Mỗi loại đều có ưu nhược điểm riêng, sữa khơ thì chi phí thấp, phổ biến và dễ sử dụng nhưng lại khơng thích hợp với nhiều loại protein, ví dụ như trong trường hợp cần phân tích biotin và các kháng thể của phosphoprotein thì khơng thể sử dụng sữa khơ, bởi vì sữa khơ có chứa casein, bản thân nó chính là một phosphoprotein và biotin, nếu sử dụng thì sẽ khơng chính xác trong kết quả [30]. Cả hai loại đều được pha ở 2.5 – 5% khối lượng trên thể tích trong TBST hoặc phosphate buffered saline (PBS).
Trường hợp lý tưởng nhất sẽ là tác nhân khóa màng (blocking) sẽ liên kết với tất cả các vị trí mà protein khơng bám vào, loại bỏ tất cả nền mà không làm thay đổi khả năng tương tác của protein quan tâm [2]. Thời gian và nồng độ tác nhân khóa màng (blocking) cũng là một vấn đề cần lưu ý đối với các thí nghiệm Western Blot. Khơng có tác nhân khóa màng (blocking) nào là lý tưởng cho mọi thí nghiệm Western Blot vì mỗi cặp kháng ngun-kháng thể có những đặc điểm riêng biệt, cần tối ưu hóa các thơng số cho từng thí nghiệm riêng lẻ.
1.4.2.5 Kháng thể thứ nhất
Nguyên tắc của Western Blot là phát hiện protein quan tâm bằng tương tác kháng nguyên – kháng thể, protein sẽ được phát hiện khi liên kết với các kháng thể thứ nhất (1oAb). Điểm tương tác thực sự xảy ra giữa một phần nhỏ của kháng nguyên (gọi là epitope) và các vị trí nhận biết được tìm thấy trên vùng Fab (fragment antigen-binding) của phân tử kháng thể (gọi là paratope)[22]. Khi lựa chọn kháng thể không chỉ cần phải chú ý đến độ nhạy và độ đặc hiệu mà còn phải chú ý đến khả năng đặc hiệu của kháng thể đó đối với protein đã bị biến tính. Bởi vì protein khi đưa vào SDS-PAGE đã bị biến tính, vì vậy cần kiểm tra kỹ lưỡng tính đặc hiệu của kháng thể. Đơi khi trình tự peptide mục tiêu sẽ không được cung cấp từ các nhà sản xuất, điều này sẽ làm cho việc xác nhận tính đặc hiệu và vùng liên kết sẽ gặp khó khăn.