2.5 Bố trí thí nghiệm 2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm 2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm Hình 2. 6 Mơ hình thí nghiệm Mẫu hCG Western Blot Khảo sát các kháng thể β1, β2 và β4 Xác định khả năng bắt cặp của các kháng thể
ELISA gián tiếp
Khảo sát các kháng thể β1, β2, β4, β9, β11. Xác định hiệu quả bắt cặp từng loại kháng thể, thu hẹp khoảng nồng độ khảo sát ELISA trực tiếp Khảo sát các kháng thể β1- ALP, β2-ALP, β4-ALP. Xác định hiệu quả, nồng độ tối ưu của từng kháng thể có gắn nhãn ALP Sandwich ELISA Cố định nồng độ kháng thể phát hiện. Khảo sát nồng độ kháng thể bắt giữ. Cố định nồng độ kháng thể bắt giữ. Khảo sát nồng độ kháng thể phát hiện Xác định cặp kháng thể nồng độ và tỉ lệ tối ưu. Cố định lên que thử LFA bằng micropipette Cố định lên que thử LFA bằng in phun nano Kết luận
2.5.2 Khảo sát khả năng bắt cặp của từng loại kháng thể
2.5.2.1 Bố trí nghiệm thức
Thí nghiệm 1 bao gồm 2 yếu tố thay đổi: loại kháng thể lai với hCG trên màng và loại
mẫu có chứa hCG. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là Western Blot.
Mục tiêu thí nghiệm: chứng minh được các kháng thể thương mại đang khảo sát có khả
năng bắt cặp với hCG có trong 3 mẫu thử thơng qua sự hiện màu các vạch trong thí nghiệm Western Blot.
Tiêu chuẩn thu mẫu: Mẫu huyết thanh và mẫu nước tiểu của phụ nữ mang thai được
thu thập từ các phòng xét nghiệm y khoa. Mẫu sẽ được xử lý sao cho nồng độ hCG đạt 10.000 mIU/mL. Bảng 2. 12 Thơng số thí nghiệm 1 Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 9 - Loại kháng thể: β1- mAb, β2- mAb, β4- mAb
- Loại mẫu: hCG tái tổ hợp, mẫu nước tiểu, mẫu huyết thanh.
- Thể tích mẫu điện di: 20µL. - Thơng số điện di: 100V, 150 phút. - Thể tích kháng thể dùng để lai: 5mL
2.5.2.2 Phương pháp tiến hành
Thí nghiệm 1
Đổ gel điện di
Tiến hành đổ gel gom (Stacking gel) và gel phân tách (Seperation gel). Bởi vì gel phân tách sẽ nằm phía dưới bản gel nên tiến hành đổ gel phân tách trước.
Gel phân tách được pha theo công thức như bảng 2.13.
Bảng 2. 13 Hóa chất pha gel phân tách
Hóa chất Thể tích (tổng 5ml) Acrylamide 30% 1,26 (ml) Tris (pH 6,8;) 1,445 (ml) Nước cất 2,634 (ml) SDS 10% 50 (µl) TEMED 5 (µl) APS 10% 50 (µl)
Dùng micropipette bơm dung dịch vào khn gel sao cho khơng tạo bọt khí đến vạch ngang có sẵn trên khn gel. Bơm lên trên một lớp isopropanol chờ cho gel được polymer hóa hết (đơng cứng) (Isopropanol giúp giảm bọt khí trên mặt gel hiệu quả hơn nước cất). Tiến hành đổ gel gom phía trên theo cơng thức trong bảng 2.14.
Bảng 2. 14 Hóa chất pha gel gom Hóa chất Thể tích (tổng 5 ml) Hóa chất Thể tích (tổng 5 ml) Acrylamide 30% 500 (μl) Tris (pH 6,8) 750 (μl) SDS 5% 100 (μl) APS 10% 50 (μl) TEMED 10 (µl) Nước cất 3,6 (ml)
Tiếp theo đổ bỏ isopropanol và rửa sạch bằng nước cất. Dùng micropipette bơm gel gom vào phía trên cho đến vạch cao nhất của khn. Đưa lược vào gel để tạo giếng. Khi gel đơng cứng hồn tồn lấy lược ra (nên chờ gel gom cứng hoàn toàn trong khoảng 30 phút, rút lược ra quá sớm sẽ dễ làm hư miệng giếng)
Chuẩn bị mẫu
Do trong huyết thanh có hàm lượng protein lớn, dễ gây quá tải trong giếng trong q trình điện di, nên cần pha lỗng với tỉ lệ 1: 1 trong dung dịch đệm PBS 10mM, pH 7.4.
Pha mẫu huyết thanh đã được pha loãng trong dung dịch PBS hoặc nước tiểu với đệm Laemmli 2x theo tỷ lệ 1:1 (v/v), ngâm trong nước 100oC trong 7 phút. Tránh khơng để thất thốt mẫu hoặc bị nước bắn vào mẫu. Thể tích mỗi mẫu tùy thuộc vào thể tích giếng. Thơng thường, mỗi mẫu có thể tích từ 30 - 70 uL là đủ.
Điện di
Đặt các gel vào bể điện di. Đổ đệm điện di (running buffer) ngập gel. Tra protein ladder và tra các mẫu vào các giếng trên gel. Đậy nắp bể điện di. Nối nguồn điện và thiết
lập hiệu điện thế 60V chạy trong 30 phút. Sau đó tăng hiệu điện thế lên 90V chạy tiếp cho đến khi các vệt màu chạy hoàn toàn ra khỏi bản gel.
Hình 2. 7 Điện di trong bể điện di
Chuyển màng
Sau khi quá trình điện di kết thúc thì tiến hành chuyển màng. Ở đây sử dụng loại màng chuyển thẩm PVDF được cung cấp theo máy Power Blotter cho nên khơng cần kích hoạt màng. Đặt bản gel vào giữa 2 lớp lọc sao cho màng PVDF nằm dưới bản gel, loại bỏ các bọt khí giữa bản gel và màng PVDF. Đặt màng chứa bản gel vào bể chuyển màng. Chuyển màng bằng chế độ High của máy Power Blotter, Invitrogen.
Khóa các vị trí trên màng
Sau khi q trình chuyển màng kết thúc thì tiến hành lấy màng ra, bỏ phần gel. Các miếng lọc có thể tái sử dụng. Có thể cắt tỉa màng cho kích thước nhỏ vừa đủ nhằm tiết kiệm dung dịch ủ kháng thể. Nên đánh dấu kích thước các vạch của thang đo (ladder). Ngâm màng trong đệm khóa màng (blocking buffer) trong 1 giờ, trên máy lắc 150 – 200 rpm.
Hình 2. 9 Màng được ngâm trong đệm khóa màng
Ủ kháng thể thứ nhất
Ngâm màng trong dung dịch đệm ủ kháng thể thứ nhất. Để tiết kiệm kháng thể, nên cho màng và kháng thể vào túi nhựa được hàn kín bằng máy hàn. Cách làm này giảm tổng thể tích sử dụng chỉ cịn 1 mL. Ủ trong tối thiểu 1 giờ. Nếu kháng thể bắt cặp yếu, có thể ủ qua đêm ở 4oC.
Rửa kháng thể thứ nhất
Sau khi ủ kháng thể xong thì tiến hành rửa trong PBS. Cho màng vào cốc, đổ PBS ngập màng. Lắc 15-20 rpm, trong 15 phút. Cách 5 phút đổ bỏ PBS cũ đi thay bằng PBS mới. Bởi vì nếu rửa quá lâu thì sẽ giảm khả năng gắn kết của kháng thể.
Hình 2. 10 Rửa kháng thể trong cốc thủy tinh với PBS
Ủ kháng thể thứ hai
Ngâm màng trong dung dịch đệm ủ kháng thể thứ hai, cách làm tương tự như ủ kháng thể thứ nhất. Bởi vì kháng thể thứ hai sẽ cho tín hiệu yếu nếu thời gian ủ khơng dài. Vì vậy, ủ kháng thể thứ hai qua đêm ở 4oC
Rửa kháng thể thứ hai
Sau khi ủ kháng thể xong thì tiến hành rửa. Cho màng vào cốc, đổ PBS ngập màng. Lắc 15-20 rpm, trong 15 phút. Cách 5 phút đổ bỏ PBS cũ đi thay bằng PBS mới. Nếu thời gian rửa quá lâu sẽ làm giảm mạnh tín hiệu của phản ứng.
Hiện màu
Kháng thể thứ hai ở đây sử dụng là kháng thể được liên hợp với enzyme Horseradish peroxidase (HRP) () nên có thể sử dụng chất phát hiện màu là TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine). Nhuộm TMB bằng cách nhỏ TMB lên bề mặt màng (thể tích khoảng 500 µl, ủ tối trong 15 phút, và chụp hình (TMB cho phép hiện màu xanh có thể nhìn bằng mắt thường và chụp được ảnh bằng bằng máy ảnh thông thường).
2.5.3 Khảo sát khả năng bắt cặp của các kháng thể
2.5.3.1 Bố trí nghiệm thức
Thí nghiệm 2 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: loại kháng thể, nồng độ kháng thể và nồng độ
hCG. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là ELISA gián tiếp
Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát khả năng bắt cặp của các loại kháng thể và thu hẹp
khoảng nồng độ khảo sát. Ngồi 3 kháng thể chính, thí nghiệm này cịn tiến hành khảo sát thêm β9- mAb và β11- mAb.
Bảng 2. 15 Thơng số thí nghiệm 2 Số nghiệm Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 125 - Loại kháng thể: β1- mAb, β2- mAb, β4- mAb, β9- mAb, β11- mAb - Nồng độ hCG: 0, 1, 10 100, 1.000, 10.000 mIU/mL - Nồng độ kháng thể: 0, 100, 500, 1.000, 10.000, 20.000 ng/mL - Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL.
- Dung dịch khóa (blocking): BSA 3%.
- Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG-HRP với độ pha loãng 1/200
- Thêm cơ chất của HRP (OPD) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 490 nm
2.5.3.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha loãng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 1, 10 , 100, 1.000, 10.000 mIU/mL.
Các kháng thể đều có nồng độ gốc là 1.000.000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.3 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 500, 1.000, 10.000, 20.000 ng/mL.
Phủ giếng bằng kháng nguyên hCG với các nồng độ khác nhau
Khóa bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng thể với các nồng độ thử nghiệm vào các giếng
Thêm kháng thể thứ cấp liên kết enzyme IgG-HRP với độ pha loãng 1/200
Thêm cơ chất của HRP (OPD) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 490 nm
Hình 2. 11 Tóm tắt quy trình khảo sát bằng
Đệm dùng rửa giếng (đệm PBS) khi thí nghiệm sẽ được pha lỗng về 1X Thí nghiệm tiến hành như sau:
- Gắn kháng nguyên lên các giếng: cho vào mỗi giếng 50 µL mẫu có chứa kháng nguyên. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu còn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể: cho vào mỗi giếng 100 µL kháng thể trong dung dịch đệm khóa (blocking buffer), ủ trong 1 giờ. Hút bỏ dung dịch trong giếng. Rửa mẫu bằng 200 µL PBS / giếng, rửa 3 - 5 lần.
- Ủ với kháng thể thứ cấp: tiến hành thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch kháng thể thứ cấp IgG-HRP pha trong dịch đệm khóa (blocking buffer, BSA 3%) với tỉ lệ pha loãng kháng thể thứ cấp là 1/200 từ dung dịch gốc có nồng độ 800 µg/mL. Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ kháng thể thứ cấp và rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/ giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 100 µL cơ chất tạo màu OPD, ủ trong 30 phút. Thêm vào mỗi giếng 100 µL H2SO4 2,5 M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 490 nM.
2.5.4 Khảo sát khả năng bắt cặp của kháng thể có gắn ALP
2.5.4.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 3 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG, nồng độ kháng thể, loại kháng
thể. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là ELISA trực tiếp.
Mục tiêu thí nghiệm: thí nghiệm này để gián tiếp xác nhận hiệu quả dán nhãn ALP
lên kháng thể và xác định nồng độ mAb – ALP phù hợp sử dụng trong phản ứng ELISA ở các thí nghiệm sau.
Bảng 2. 16 Thơng số thí nghiệm 3
Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú
40 - Nồng độ hCG: 0, 1, 10, 50, 100, 500, 1.000, 10.000 (mIU/ml). - Nồng độ kháng thể gắn ALP: 0, 100, 1.000, 2.000, 4.000 (ng/ml). - Loại kháng thể: mAb - β1- ALP, mAb - β2 - ALP, mAb - β4 - ALP.
- Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL. - Dung dịch blocking: BSA 3%. - Kháng thể đã được gắn sẵn Alkaline Phosphatase. Hiện màu bằng p-nitrophenyl phosphate. Dung dịch chuyển thành màu vàng. - Đo OD và so sánh 3 loại kháng thể với nhau.
2.5.4.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha loãng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 1, 10 , 100, 1.000, 10.000 mIU/mL.
Gắn ALP vào ba loại kháng thể β1- mAb, β2- mAb và β4- mAb (quy trình gắn nhãn ALP được trình bày trong phần 2.3.4). Các kháng thể đều có nồng độ gốc là 1.000.000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.3 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 1.000, 2.000, 4.000 (ng/ml).
Đệm dùng rửa giếng (đệm PBS) khi thí nghiệm sẽ được pha lỗng về 1X.
Phủ giếng bằng kháng nguyên (hCG) với các nồng độ khác nhau
Khóa bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng thể đơn dòng liên kết enzyme với độ pha loãng khác nhau
Thêm cơ chất của ALP (pNPP) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 405 nm
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Gắn kháng nguyên (hCG) lên các giếng: cho vào mỗi giếng 100 µL mẫu có chứa kháng thể. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu còn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với kháng thể đơn dòng đã dán nhãn ALP (mAb-ALP): thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch mAb-ALP pha trong dung dịch đệm khóa (BSA 3%). Ủ mẫu trong 1 giờ. Hút bỏ mAb-ALP và rửa giếng 4 lần với dung dịch đệm PBS (200 µL/lần/giếng).
- Ủ với cơ chất tạo màu và đọc kết quả: cho vào mỗi giếng 200 µL cơ chất tạo màu pNPP, ủ trong 30 phút. Thêm vào mỗi giếng 50 µL NaOH 3M để dừng phản ứng trước khi tiến hành đọc kết quả OD bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm.
2.5.5 Khảo sát hiệu quả bắt cặp của kháng thể bắt giữ
2.5.5.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 4 bao gồm 3 yếu tố thay đổi: nồng độ hCG, nồng độ kháng thể phủ giếng
(kháng thể bắt giữ), loại kháng thể phủ giếng. Phương pháp sử dụng cho thí nghiệm này là Sandwich ELISA.
Mục tiêu thí nghiệm: xác định được nồng độ kháng thể phủ giếng tối ưu nhất cho từng
loại kháng thể. Bảng 2. 17 Thơng số thí nghiệm 4 Số nghiệm thức Nghiệm thức Ghi chú 48 - Nồng độ kháng thể phủ giếng: 0, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL - Nồng độ hCG: 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000 mIU/ml. - Nồng độ kháng thể phát hiện (mAb-ALP) cố định theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.4. - Cặp kháng thể sử dụng: β1- β2(ALP), β2 – β1(ALP), β4 – β2(ALP). - Thể tích hCG: 100µL. - Thể tích kháng thể: 100µL. - Dung dịch blocking: BSA 3%. - Kháng thể đã được gắn sẵn Alkaline Phosphatase. Hiện màu bằng p-
nitrophenyl phosphate. Dung dịch chuyển thành màu vàng.
- Đo OD và so sánh 3 loại kháng thể với nhau.
2.5.5.2 Phương pháp tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
hCG của hãng Sigma có nồng độ gốc 1.000.000 mIU/ml sẽ được pha loãng trong đệm phủ giếng (Coating buffer, cơng thức trình bày trong phần 2.1 – Phụ lục A) ra thành các nồng độ 0, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10,000 mIU/ml.
Kháng thể phủ giếng đều có nồng độ gốc là 1.000,000 ng/ml sẽ được pha loãng trong đệm ủ kháng thể (Blocking buffer, cơng thức trình bày trong bảng 2.8) ra thành các nồng độ 0, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 5.000 ng/mL. Đệm dùng rửa giếng khi thí nghiệm sẽ được pha loãng về 1X.
Phủ giếng bằng kháng thể với các nồng độ khác nhau
Khóa bằng dung dịch BSA3%
Thêm kháng nguyên (hCG) với các nồng độ pha lỗng khác nhau
Thêm kháng thể đơn dịng có dán nhãn ALP
Thêm cơ chất của ALP (pNPP) vào giếng. Ủ và đo OD ở bước sóng 405 nm
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
- Gắn kháng thể lên các giếng: cho vào mỗi giếng 100 µL mẫu có chứa kháng thể. Ủ mẫu trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch trong các giếng. Rửa mẫu cịn dư bằng 200 µL PBS/ giếng, rửa 3 lần.
- Khóa các giếng: cho vào mỗi giếng 200 µL dung dịch đệm khóa (blocking buffer BSA 3%), ủ khoảng 1 giờ rồi hút bỏ dung dịch và rửa lại giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS. Làm sạch đĩa bằng giấy thấm.
- Ủ với 50 mL kháng nguyên (hCG) được pha lỗng trong dung dịch đệm khóa