Ưu điểm Nhược điểm
Quy trình đơn giản dễ thực hiện. Độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiệu quả cao.
Tương đối an tồn khi thực hiện. Khơng tiêu tốn một lượng lớn các dung
mơi hay các chất phóng xạ.
Chi phí cho thuốc thử và máy móc khơng q cao.
Kháng thể sử dụng rất đắt tiền.
Yêu cầu kỹ thuật cao và môi trường đắt tiền trong trường hợp mẫu nuôi cấy. Dễ xảy ra dương tính, âm tính giả. Blocking không tốt sẽ làm sai kết quả. Kháng thể không ổn định.
1.5.2 Phân loại các phương pháp ELISA
1.5.2.1 Direct ELISA
Direct ELISA hay còn gọi là ELISA trực tiếp, đây là phương pháp ELISA đầu tiên được phát minh vào năm 1971 bởi đồng thời hai nhóm nghiên cứu Engvall và Perlmann [14] và nhóm nghiên cứu Van Weemen và Schuurs [45]. Đây là kỹ thuật đi tiên phong trong các kỹ thuật ELISA, nó được dùng làm cơ sở để phát triển ra những loại hình ELISA sau này. Direct ELISA thích hợp để xác định các kháng nguyên có trọng lượng phân tử lớn.
Hình 1. 5 Direct ELISA
Một kháng nguyên hoặc một kháng thể sẽ được gắn cố định trên pha rắn (thành giếng của đĩa ELISA). Những vị trí cịn trống trên thành giếng sẽ được lấp đầy bằng các protein khác (ví dụ như albumin, gelatin, casein và skimmed-milk), nhằm ngăn chặn sự gắn kết của các protein không mong muốn. Một kháng thể được cộng hợp với enzyme
sẽ được cho vào để liên kết với lớp kháng nguyên đã bám vào thành giếng. Cơ chất của enzyme sẽ được thêm vào nhằm tạo màu cho dung dịch. Số lượng protein mục tiêu càng nhiều thì màu càng đậm. Đo mật độ quang của dung dịch so với một chất chuẩn sẽ có được nồng độ của protein đang quan tâm.
1.5.2.2 Indirect ELISA
Indirect ELISA hay còn gọi là ELISA gián tiếp, đây là phương pháp được phát triển từ Direct ELISA bởi Lindstrom và Wager vào năm 1978 [26]. Đúng với tên gọi ELISA gián tiếp, kháng nguyên cần quan tâm sẽ được phát hiện một cách gián tiếp thơng qua một kháng thể thứ hai có gắn enzyme đã được đánh dấu. Trong một phản ứng thì sẽ có tới hai kháng thể được sử dụng.
Đầu tiên, kháng nguyên cần xác định sẽ được gắn cố định trên pha rắn (thành giếng của đĩa ELISA). Tiếp theo sẽ được khóa các vị trí cịn trống bằng các protein như ở Direct ELISA. Một kháng thể thứ nhất sẽ được thêm vào tạo liên kết với lớp kháng nguyên vừa gắn lên thành giếng. Một kháng thể thứ hai cộng hợp enzyme sẽ được gắn vào kháng thể thứ nhất. Cơ chất của enzyme sẽ được thêm vào để tạo màu cho phản ứng. Dựa vào cường độ tín hiệu màu sẽ tính tốn ra được nồng độ kháng nguyên. Kháng thể thứ nhất thường là các huyết thanh miễn dịch (antisera), có thể đánh giá sự hiện diện của các kháng thể trong antisera. Vì vậy, Indirect ELISA thường được dùng định lượng các đại phân tử, chẩn đoán các bệnh nội tiết [20].
1.5.2.3 Sandwich ELISA
Sandwich ELISA cũng được phát triển bởi Kanefusa Kato và các cộng sự vào năm 1977 [17], cũng giống như phương pháp Indirect ELISA, Sandwich ELISA được phát triển từ phương pháp ELISA truyền thống. Phương pháp này có tên là Sandwich ELISA là bởi vì kháng nguyên cần phát hiện sẽ được kẹp giữa 2 kháng thể tạo thành cấu trúc giống một bánh Sandwich với phần vỏ là 2 kháng thể kẹp giữa phần nhân là kháng nguyên cần phát hiện. Bởi vì sử dụng hai kháng thể bắt đồng thời vào kháng nguyên quan tâm, điều này có nghĩa là cần lựa chọn 2 kháng thể thích hợp để bắt vào 2 vị trí epitope khác nhau trên kháng nguyên, cho nên phương pháp ELISA cho độ nhạy và độ chính xác cao hơn các phương pháp ELISA khác. Phương pháp này có nhược điểm là chi phí cho 2 kháng thể rất cao và thời gian thực hiện dài hơn nhiều so với các phương pháp ELISA khác.
Đầu tiên, các giếng ELISA sẽ được phủ một lớp kháng thể phía dưới. Blocking các vị trí mà kháng thể khơng cố định vào. Kháng ngun cần phát hiện sẽ được thêm vào, chúng sẽ bắt đặc hiệu với lớp kháng thể đã phủ xuống trước đó. Kháng thể thứ hai cộng hợp enzyme sẽ được thêm vào cuối cùng, bắt đặc hiệu với kháng nguyên tạo thành
1 lớp trên cùng. Sau đó, cơ chất của enzyme sẽ được thêm vào để phát tín hiệu màu. Dựa vào cường độ tín hiệu màu sẽ xác định được nồng độ kháng nguyên cần quan tâm.
Hình 1. 7 Sandwich ELISA
1.6 Kỹ thuật LFA định lượng
1.6.1 Tổng quan phương pháp Lateral Flow Assay
Kỹ thuật Lateral Flow Assay (LFA) được ứng dụng nhiều nhất trong các xét nghiệm sắc kí miễn dịch (immunochromatographic). Phổ biến nhất thường thấy chính là que thử thai. Tuy nhiên, kỹ thuật LFA cơ bản chỉ có thể dùng để định tính. Tất cả thuốc thử có liên quan đến phân tích sẽ được cố định trên màng của que thử. Khi que thử tiếp xúc với mẫu thử ở dạng lỏng, dưới tác dụng của mao dẫn sẽ tạo thành dòng chảy cuốn tất cả các thành phần chạy qua toàn bộ que thử. Mẫu thử, kháng thể, chất chỉ thị hiện màu sẽ được phản ứng với nhau tạo thành các vệt màu trên màng que thử. Dựa vào sự hiện màu hoặc không hiện màu sẽ có thể kết luận về sự hiện diện của kháng nguyên trong mẫu thử [44].
Hình 1. 8 Kỹ Thuật LFA cơ bản
Xu hướng “tại chỗ” giúp các phân tích cho kết quả nhanh chóng và đơn giản hơn, cung cấp những thông tin cần thiết để đưa ra các quyết định tiếp theo. Xu hướng này còn mang ý nghĩa quan trọng trong việc kiểm sốt bệnh dịch thơng qua việc phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh, phát hiện sự rối loạn chuyển hóa và chức năng thông qua những thay đổi về mặt sinh hóa trong các mẫu thử. Tuy nhiên, nhược điểm của LFA chính là việc chỉ có thể định tính. Do đó, kỹ thuật LFA định lượng ra đời nhằm giữ được những ưu điểm của LFA cơ bản nhưng vẫn cung cấp được những thơng tin hữu ích về định lượng kháng nguyên có trong mẫu [44].
1.6.2 Một số phương pháp LFA định lượng
Phương pháp cổ điển nhất có thể kể đến là phương pháp xác định tổng cường độ nhuộm màu. Cụ thể, hệ thống phân tích sẽ có một hệ thống phát sáng tập trung vào vùng phản ứng trên que thử, que thử sẽ phản xạ lại ánh sáng từ nguồn sáng. Thiết bị thu nhận tín hiệu sẽ thu nhận các tín hiệu phản xạ khác nhau, từ đó cho ra kết quả định lượng [44].
Phương pháp phổ biến hơn hiện nay là định lượng bằng các chất hiện màu quang học hay cịn gọi là nhãn quang học có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Hệ thống định lượng LFA dạng này đều được các nhà sản xuất tối ưu để có thể thơng qua cường độ màu sẽ định lượng chính xác được mẫu kháng nguyên. Kháng thể sử dụng cho phương pháp này thường sẽ được gắn thêm các hạt vàng dùng để tăng cường độ hiện màu [44]. Phương pháp LFA định lượng bằng các hạt từ tính. Phương pháp này cũng có thể định lượng được hàm lượng kháng nguyên trong mẫu, tuy nhiên, kết quả phân tích sẽ khơng thể nhìn thấy bằng mắt thường trên que thử, chỉ khi đặt trong từ trường mới có thể cho ra kết quả định lượng. Phương pháp này hiệu quả hơn hai phương pháp kể trên là do nó có thể tương tác được với những hạt từ trường nằm sâu trong lòng que thử, trong khi hai phương pháp kể trên chỉ có thể phân tích trên bề mặt que thử [44]. Vì vậy, kết quả định lượng sẽ tốt hơn nhưng sẽ cần thiết bị và quy trình phức tạp hơn.
Ngồi ra, cịn có một phương pháp là LFA sử dụng nhãn dẫn điện (thường là các hạt nano kim loại) hoặc nhãn kích thích để tạo/ biến đổi các hợp chất dẫn điện (enzym oxy hóa) để phát hiện chất đích thơng qua sự dao động của dịng điện, điện áp hoặc điện trở. Tuy nhiên, phương pháp này không phổ biến và rất ít ứng dụng thực tiễn [44].
1.7 Phần mềm ImageJ
Phần mềm ImageJ là một phần mềm dùng để đo cường độ màu, đây là phần mềm mã nguồn mở được phát triển bởi NIH - National Institutes of Health. ImageJ được thiết kế để xử lý nhiều loại dữ liệu hình ảnh khác nhau trên nhiều nền tảng máy tính và được các nhà khoa học ứng dụng rất rộng rãi cho việc phân tích dữ liệu hình ảnh. Các định dạng hình ảnh mà ImageJ có thể xử lý được bao gồm TIFF, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS VÀ RAW.
ImageJ có rất nhiều tính năng hữu ích, nhưng trong luận văn này chỉ quan tâm đến tính năng Histogram. Tại đây, 1 vùng màu bất kỳ của hình ảnh được đưa vào sẽ được quét nhằm tiến hành đo cường độ màu (color intensity). Tính năng Histogram của ImageJ cho phép người dùng có thể đo cường độ RGB của vùng màu được chỉ thị hoặc đo riêng lẻ cường độ từng màu trong bộ RGB (đỏ, xanh lam, xanh lá). Kết quả trả về sẽ biểu thị ở dạng số 0 đến 256. Kết quả trả về sẽ biểu thị ở dạng số 0 đến 256. Chỉ số cường độ màu càng gần 0 đồng nghĩa với việc phần màu hiển thị tại ví trí đó càng đậm (cường độ màu cao) và ngược lại. Đây chính là tính năng rất phổ biến cho việc phân tích cường độ phổ màu RGB.
1.8 Tình hình nghiên cứu về LFA
Dimitra K. Toubanaki và các cộng sự đã tiến hành phát triển một cảm biến sinh học giúp phát hiện các thành phần vỏ bọc (hạt virus hay virion) của nodavirus hay còn biết đến như là loại virus gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá. Trước đây, để phát hiện virus thường sử dụng phương pháp PCR nên quy trình rất phức tạp và mất rất nhiều thời gian. Vì vậy, nhóm tác giả đã sử dụng anti-nodavirus antibody liên hợp với các hạt nano vàng (Au NPs) nhờ sự tích lũy màu của các hạt nano vàng sẽ tạo thành vùng màu đỏ trên cảm biến, giúp xác định mẫu âm tính hoặc dương tính và cả những mẫu kết quả khơng rõ ràng để có thể tiến hành các thí nghiệm chun sâu hơn trong phịng thí nghiệm [41].
Hagström và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu, cải tiến một thiết bị cảm biến sinh học dùng để phát hiện norovirus, một loại virus gây bệnh viêm dạ dày cấp tính (khơng phải do vi khuẩn gây ra) ở người. Nhóm đã sử dụng SAM-AviTag M13 phage – một bacteriophage để làm chất phát tín hiệu, sau khi tiến hành so sánh với việc sử dụng nano vàng thì việc sử dụng phage giúp làm tăng độ nhạy lên 100 lần khi sử dụng cùng một cặp kháng thể. Tuy nhiên, chất giúp hiện màu là TMB (3,3',5,5'- Tetramethylbenzidine), cộng thêm việc phải nuôi cấy phage và đảm bảo chức năng của phage hoạt động bình thường, thì dù độ nhạy có tăng lên 100 lần nhưng để thương mại hóa vẫn cần nghiên cứu thêm [16].
Ruihua Tang và các cộng sự đã tiến hành cải tiến cấu tạo của một que thử LFA truyền thống bằng cách thêm vào giữa phần đệm chứa chất chỉ thị liên hợp (conjugation pad) và phần màng nitrocellulose một lớp đệm xốp dạng bọt biển. Nghiên cứu trên mẫu thử là Hepatitis B virus (HBV). Kết quả cho thấy, việc hiệu chỉnh que thử sẽ giúp tăng tín hiệu gấp 10 lần so với que thử thông thường. [40].
Christoph Ruppert và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu một hệ thống đọc kết quả bằng điện thoại thông minh (smartphone) cho các xét nghiệm LFA có gắn nano vàng, hệ thống này được phát triển nhằm theo dõi digoxigenin. Que thử được thiết kế
theo phương pháp LFA có chứa các kháng thể liên hợp với các hạt nano vàng. Các dải hiện màu sẽ được đặt trong một hộp đen và chụp hình lại bằng smartphone, cường độ màu sẽ tỉ lệ với nồng độ digoxigenin có trong mẫu. Dữ liệu hình ảnh sẽ được nhóm nghiên cứu xử lý đồng thời bằng hai phần mềm là ImageJ và phần mềm mã nguồn mở R-package GNSplex. Kết quả cho thấy xét nghiệm digoxin dựa trên điện thoại thông minh mang lại kết quả định lượng đáng tin cậy trong phạm vi nồng độ phù hợp về mặt lâm sàng [38].
Jiaxin Liu và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chế tạo một cảm biến sinh học dùng phát hiện Nervous necrosis virus (NNV), một loại virus gây bệnh trên hơn 50 loài cá trên tồn thế giới. Nhóm nghiên cứu đã phát triển một phương pháp cảm biến sinh học dòng chảy bên (LFA) dựa trên aptamer đơn giản và nhạy để phát hiện nhanh chóng vi rút hoại tử thần kinh cá mú đốm đỏ (RGNNV - red-spotted grouper nervous necrosis virus). Aptamer là một nucleotide mạch đơn, có thể liên kết đặc biệt với protein trên vỏ ngoài của virus. Nghiên cứu này cũng sử dụng hạt nano vàng dùng làm chất hiện màu, kết quả phân tích có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Cảm biến này có thể phát hiện protein của virus ở mức 5 ng/mL hoặc 5.103 tế bào nhiễm virus [28].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp luận
Việc lựa chọn được loại kháng thể thương mại phù hợp nhất phụ thuộc rất lớn vào vị trí epitope. Epitope là vị trí đặc hiệu mà các kháng thể đơn dịng bắt cặp với hCG. Cần lựa chọn các epitope có khả năng bắt đặc hiệu với tất cả các biến thể hCG nhưng lại khơng bắt với các protein khác trong nhóm glycoprotein hormone. Vì vậy, các epitope hướng đến sẽ nằm trên tiểu phần β.
Epitope β1 được phát hiện có mặt ở tất cả các biến thể của hCG / hCGβ bao gồm cả các mảnh lõi của hCGβ nhưng lại không xuất hiện trên hLH (một protein khác trong nhóm GLH), vị trí epitope này sẽ giúp phát hiện các biến thể của hCG một cách toàn diện và đặc hiệu. Epitopes β2 và β4 cũng cho thấy độ đặc hiệu nhất định khi bắt cặp với các biến thể của hCG và cả 2 loại kháng thể này đều bắt giữ được nhiều biến thể của hCGβ, vì vậy, rất phù hợp cho việc chọn lọc hCG [5].
Việc lựa chọn kháng thể trong đề tài này được lựa chọn bằng cách tham khảo báo cáo của Berger và các cộng sự trong các hội nghị ISOBM TD 7. Ba kháng thể có tính đặc hiệu với 7 biến thể của hCG, với mã kháng thể (code-mAbs) là INN-hCG-2, INN- hCG-22 và INN-hCG-24. Đây là các kháng thể có nguồn gốc từ Viện Nghiên cứu Y sinh học về Lão hóa (INN), thuộc đại học Innsbruck, Áo [5].
Mục tiêu chính là tạo ra cảm biến sinh học có khả năng bắt được hCG trong mẫu dựa trên phương pháp Sandwich ELISA, trong đó một kháng thể sẽ bắt giữ hCG và một kháng thể cịn lại giúp phát ra tín hiệu màu. Tỉ lệ nồng độ của cặp kháng thể đóng vai trị rất quan trọng. Cặp kháng thể phải đảm bảo đầy đủ tính ổn định khi bắt cặp với hCG ở những dãy nồng độ khác nhau, đặc biệt là ở những nồng độ thấp. Sau đó, cặp kháng thể sẽ được gắn lên các que thử LFA nhằm kiểm tra khả năng tương thích và tính khả thi của ý tưởng dùng cảm biến sinh học nhằm định lượng hCG.
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm sinh học, Viện cơng nghệ Nano, đại học Quốc Gia Tp.HCM trong thời gian tháng 8/2020 đến 4/2021.
2.3 Nguyên vật liệu
2.3.1 Mẫu hCG và kháng thể
Nguyên liệu chính cho các thí nghiệm trong luận văn này là hCG. Nguồn hCG cho các thí nghiệm đến từ ba nguồn là hCG tái tổ hợp, mẫu huyết thanh của phụ nữ đang mang thai và mẫu nước tiểu của phụ nữ đang mang thai.