CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 Bố trí thí nghiệm
2.5.2.2 Phương pháp tiến hành
Thí nghiệm 1
Đổ gel điện di
Tiến hành đổ gel gom (Stacking gel) và gel phân tách (Seperation gel). Bởi vì gel phân tách sẽ nằm phía dưới bản gel nên tiến hành đổ gel phân tách trước.
Gel phân tách được pha theo công thức như bảng 2.13.
Bảng 2. 13 Hóa chất pha gel phân tách
Hóa chất Thể tích (tổng 5ml) Acrylamide 30% 1,26 (ml) Tris (pH 6,8;) 1,445 (ml) Nước cất 2,634 (ml) SDS 10% 50 (µl) TEMED 5 (µl) APS 10% 50 (µl)
Dùng micropipette bơm dung dịch vào khn gel sao cho khơng tạo bọt khí đến vạch ngang có sẵn trên khn gel. Bơm lên trên một lớp isopropanol chờ cho gel được polymer hóa hết (đơng cứng) (Isopropanol giúp giảm bọt khí trên mặt gel hiệu quả hơn nước cất). Tiến hành đổ gel gom phía trên theo công thức trong bảng 2.14.
Bảng 2. 14 Hóa chất pha gel gom Hóa chất Thể tích (tổng 5 ml) Hóa chất Thể tích (tổng 5 ml) Acrylamide 30% 500 (μl) Tris (pH 6,8) 750 (μl) SDS 5% 100 (μl) APS 10% 50 (μl) TEMED 10 (µl) Nước cất 3,6 (ml)
Tiếp theo đổ bỏ isopropanol và rửa sạch bằng nước cất. Dùng micropipette bơm gel gom vào phía trên cho đến vạch cao nhất của khn. Đưa lược vào gel để tạo giếng. Khi gel đơng cứng hồn tồn lấy lược ra (nên chờ gel gom cứng hoàn toàn trong khoảng 30 phút, rút lược ra quá sớm sẽ dễ làm hư miệng giếng)
Chuẩn bị mẫu
Do trong huyết thanh có hàm lượng protein lớn, dễ gây quá tải trong giếng trong q trình điện di, nên cần pha lỗng với tỉ lệ 1: 1 trong dung dịch đệm PBS 10mM, pH 7.4.
Pha mẫu huyết thanh đã được pha loãng trong dung dịch PBS hoặc nước tiểu với đệm Laemmli 2x theo tỷ lệ 1:1 (v/v), ngâm trong nước 100oC trong 7 phút. Tránh khơng để thất thốt mẫu hoặc bị nước bắn vào mẫu. Thể tích mỗi mẫu tùy thuộc vào thể tích giếng. Thơng thường, mỗi mẫu có thể tích từ 30 - 70 uL là đủ.
Điện di
Đặt các gel vào bể điện di. Đổ đệm điện di (running buffer) ngập gel. Tra protein ladder và tra các mẫu vào các giếng trên gel. Đậy nắp bể điện di. Nối nguồn điện và thiết
lập hiệu điện thế 60V chạy trong 30 phút. Sau đó tăng hiệu điện thế lên 90V chạy tiếp cho đến khi các vệt màu chạy hoàn toàn ra khỏi bản gel.
Hình 2. 7 Điện di trong bể điện di
Chuyển màng
Sau khi quá trình điện di kết thúc thì tiến hành chuyển màng. Ở đây sử dụng loại màng chuyển thẩm PVDF được cung cấp theo máy Power Blotter cho nên khơng cần kích hoạt màng. Đặt bản gel vào giữa 2 lớp lọc sao cho màng PVDF nằm dưới bản gel, loại bỏ các bọt khí giữa bản gel và màng PVDF. Đặt màng chứa bản gel vào bể chuyển màng. Chuyển màng bằng chế độ High của máy Power Blotter, Invitrogen.
Khóa các vị trí trên màng
Sau khi q trình chuyển màng kết thúc thì tiến hành lấy màng ra, bỏ phần gel. Các miếng lọc có thể tái sử dụng. Có thể cắt tỉa màng cho kích thước nhỏ vừa đủ nhằm tiết kiệm dung dịch ủ kháng thể. Nên đánh dấu kích thước các vạch của thang đo (ladder). Ngâm màng trong đệm khóa màng (blocking buffer) trong 1 giờ, trên máy lắc 150 – 200 rpm.
Hình 2. 9 Màng được ngâm trong đệm khóa màng
Ủ kháng thể thứ nhất
Ngâm màng trong dung dịch đệm ủ kháng thể thứ nhất. Để tiết kiệm kháng thể, nên cho màng và kháng thể vào túi nhựa được hàn kín bằng máy hàn. Cách làm này giảm tổng thể tích sử dụng chỉ cịn 1 mL. Ủ trong tối thiểu 1 giờ. Nếu kháng thể bắt cặp yếu, có thể ủ qua đêm ở 4oC.
Rửa kháng thể thứ nhất
Sau khi ủ kháng thể xong thì tiến hành rửa trong PBS. Cho màng vào cốc, đổ PBS ngập màng. Lắc 15-20 rpm, trong 15 phút. Cách 5 phút đổ bỏ PBS cũ đi thay bằng PBS mới. Bởi vì nếu rửa quá lâu thì sẽ giảm khả năng gắn kết của kháng thể.
Hình 2. 10 Rửa kháng thể trong cốc thủy tinh với PBS
Ủ kháng thể thứ hai
Ngâm màng trong dung dịch đệm ủ kháng thể thứ hai, cách làm tương tự như ủ kháng thể thứ nhất. Bởi vì kháng thể thứ hai sẽ cho tín hiệu yếu nếu thời gian ủ khơng dài. Vì vậy, ủ kháng thể thứ hai qua đêm ở 4oC
Rửa kháng thể thứ hai
Sau khi ủ kháng thể xong thì tiến hành rửa. Cho màng vào cốc, đổ PBS ngập màng. Lắc 15-20 rpm, trong 15 phút. Cách 5 phút đổ bỏ PBS cũ đi thay bằng PBS mới. Nếu thời gian rửa quá lâu sẽ làm giảm mạnh tín hiệu của phản ứng.
Hiện màu
Kháng thể thứ hai ở đây sử dụng là kháng thể được liên hợp với enzyme Horseradish peroxidase (HRP) () nên có thể sử dụng chất phát hiện màu là TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine). Nhuộm TMB bằng cách nhỏ TMB lên bề mặt màng (thể tích khoảng 500 µl, ủ tối trong 15 phút, và chụp hình (TMB cho phép hiện màu xanh có thể nhìn bằng mắt thường và chụp được ảnh bằng bằng máy ảnh thông thường).