Hiện nay, bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề ương nuôi cá thương phẩm. Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do vi khuẩn đã được ghi
nhận như: bệnh đốm trắng ở thận trên cá Giò nuôi thương phẩm, bệnh vibriosis, bệnh mòn vây cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá Mú, cá Giò, cá Chẽm (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2008) [7], [27], [45].
Theo thống kê ở Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ nuôi cá biển bị chịu tác
hại của bệnh do vi khuẩn. Bệnh có thể xảy ra ở nhiều loài cá biển nuôi, và ở các giai đoạn khác nhau, không có mùa vụ rõ ràng. Đặc biệt, giai đoạn cá nhỏ (5- 20cm) tác hại của bệnh do vi khuẩn lớn hơn giai đoạn cá lớn với tỷ lệ chết có thể lên đến 50-100% (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2008).
Các vi khuẩn gây bệnh trên cá biển đã được biết như: Vibri, Streptococcus, Aeromonas, Flexibacter, Pseudomonas fluorescents,., Photobacterium damsela. Trong đó, nhóm vi khuẩn Vibrio gây bệnh đang được
chú ý hơn cả vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hưởng nghiêm trọng của chúng
trong nghề nuôi trồng thủy sản hiện nay.
Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy
sản do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra. Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh
hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh vibriosis ở động vật thủy sản [51].
Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đối với động vật thủy sản. V. anguillarum, V.salmonicida, và V.vulnificus là ba trong số những loài gây bệnh
rất phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi
dẫn đến chết toàn bộ [52], [61].
Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh,
bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề
nuôi thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn, sự
phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ.
Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đangđược nuôi phổ biến ở nhiều
quốc gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer)
thường bị bệnh này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển (Liopo và cộng
sự, 2001). Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ
nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ,
sâu. Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải
rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, và V. anguillarum. Ngoài ra có những báo
cáo khác về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V. anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V. salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh
[7], [64].
Tình hình bệnh dịch và nguyên nhân gây bệnh ở trên các loài cá nuôi
thương phẩm như cá mú, cá chẽm, cá giò đã được nhiều nghiên cứu công bố. Tuy
nhiên do cá Chim vây vàng mới được đưa vào nuôi thương phẩm trong thời gian
gần đây nên chưa có nghiên cứu cụ thể về dịch bệnh được công bố (kể cả trong nước và ngoài nước), nhưng qua thực tiễn nuôi cá Chim vây vàng ở lồng trên biển, chúng tôi quan sát thấy số lượng cá bị hao hụt do bệnh tật là tương đối lớn.
Chúng tôi cũng đã tiến hành thu phân lập các chủng gây bệnh trên cá Chim vây vàng bị bệnh, kết quả là có rất nhiều vi khuẩn Vibrio. Đây là một cơ sở để kiểm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tra và xem xét các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên loài cá này trong tương lai. Để làm sáng tỏ vấn đề này thì cần các nghiên cứu cụ thể để đánh giá cũng như đưa ra các biện pháp khắc phục để phát triển nghề nuôi thương phẩm cá Chim vây vàng.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 2.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus được phân lập từ nội tạng cá Chim vây vàng. Nội tạng được lấy từ những cá thể cá Chim vây vàng được nuôi tại lồng
nuôi của Trường Đại học Nha Trang (Vũng Ngán – Tp.Nha Trang – Khánh Hòa), sống sót và đã trải qua một số đợt bệnh dịch.
2.1.2. Vi sinh vật chỉ thị
Các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh (Vp.1, Vp.2, Vh.1, Vh.2, Vc.1, Vc.2 và Vc.3) lấy từ bộ sưu tập chủng của Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nha Trangđược nuôi cấy trên môi trường TCBS. Các chủng này
được sử dụng để xác định khả năng kháng khuẩn của các chủng Lactobacillus
phân lập được.
2.1.3. Cá Chim vây vàng
Cá Chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) (1-2g/con) lấy từ
trại cá Hòn Một –Tp.Nha Trang được nuôi bằng thức ăn công nghiệp do hãng INVE sản xuất.
2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường MRS (g/l):dùng để phân lập và nuôi cấy Lactobacillus spp.
Đường glucose 20,0 CH3COONa 5,0
Cao nấm men 5,0 Amoni xitrat 2,0
Cao thịt 10,0 MgSO4.7H2O 0,05
Pepton 10,0 MnSO4.4H2O 0,2
K2HPO4 2,0 Agar 14,0
Tween 80 1 ml Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH= 6,5; khử trùng ở 121oC/15 phút
Môi trường thạch thường (g/l): dùng để xác định tổng số vi sinh vật, thử khả năng đối kháng
Thạch 15,0 NaCl 1,0
Pepton 5,0 Nước cất vừa đủ 1000ml
Cao thịt 2,0
pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút
Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,0, sau đó thêm agar vào. Hấp khử trùng ở 1210 C trong 15 phút.
Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar) (g/l): dùng để
nuôi cấy Vibrio spp.
Đường glucose 20,0 Pepton 5,0 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Agar 14,0 Oxgall 5,0
NaCL 10,0 Natri Cholate 3,0
Natri Xitrat 10,0 Ferric Citrate 15,0
Na2S2O4 10,0 Thymol Blue 0,04
Cao nấm men 5,0 Brom Thymol Blue 0,04
Casein thủy phân 5,0 Nước cất vừa đủ 1000ml
pH= 8,6; khử trùng ở 121oC/15 phút [32].
Môi trường APW (Ancalin Peptone Water) (g/l): dùng để nuôi cấy Vibrio spp.
Pepton 20,0 NaCl 10,0 Nước cất vừa đủ 1000ml pH= 8,5; khử trùng ở 121oC/15 phút Môi trường LB (g/l) Bacto-Tryptone 10 NaCl 10
Cao nấm men 5 Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút. [32]
2.1.5. Các thiết bị chuyên dụng
- Thiết bị lên men tự động BioFlo 110 (New Brunswick, Thụy Sĩ). - Máy đông khô Lyo Beta 35 (Telstar, Tây Ban Nha).
- Tủ cấy vi sinh (Telstar, Tây Ban Nha). - Máy ly tâm lạnh(Netheler, Đức).
- Máy đo pH (Horiba, Nhật Bản)
- Tủ lạnh (Nano Silver, Việt Nam).
- Tủ ấm (Memmert, Đức)
- Máy lắc (Memmert, Đức)
- Kính hiển vi (Motic BA 300, Trung Quốc).
- Máy đo quang phổ UV-VIS (Cary 100 Bio, Úc).
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân lập Lactobacillus 2.2.1. Phân lập Lactobacillus
Cân 5g mẫu nội tạng của cá Chim vây vàng cho vào túi nilon, bổ sung
45 ml môi trường tăng sinh để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng máy dập
mẫu Stomacher trong 1 phút. Sau đó cho vào bình tam giác và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau 24h đem pha loãng thành các nồng độ 10-2 đến 10-7. Hút 0,1 ml mẫu (Trần Linh Thước, 2007) từ ba nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 đổ vào đĩa thạch
MRS đã chuẩn bị, dùng trang cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Sau đó nuôi các
đĩa petri đã cấy mẫu vào tủ ấm 370C trong 1 - 2 ngày. Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Quan sát hình thái, màu sắc
khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ các loài thuộc giống Lactobacillus. Chúng được tách
ra và tiếp tục được cấy ria nhiều lần trên môi trường MRS để thuần khiết, sau đó được đánh số và cấy truyền vào ống thạch nghiêng MRS giữ giống [12], [14].
2.2.2. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio
Từ môi trường giữ giống, các chủng Lactobacillus và Vibrio được đưa vào môi trường lỏng tương ứng (Lactobacillus nuôi trên môi trường MRS, Vibrio nuôi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trên môi trường APW) và nuôi hoạt hóa qua đêm ở 370C. Khi mật độ tế bào của
Vibrio đạt khoảng 104 CFU/ml và mật độ tế bào Lactobacillus đạt khoảng 105
CFU/ml thì Vibrio được trang đều trên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường LB đã chuẩn bị sẵn (Ravi và cộng sự, 2007). Sau đó đục các lỗ thạch đường kính khoảng 5 mm, hút 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus cho vào các lỗ khoan. Các đĩa đã cấy được nuôi trong tủ ấm 370C, sau 1 ÷ 2 ngày quan sát các vòng kháng khuẩn
Để chọn lựa được các chủng Lactobacillus kháng lại Vibriocó độ tin cây
cao thì các chủng được lựa chọn qua 3 vòng thử đối kháng. Vòng 1 tiến hành thử đối kháng tất cả các chủng Lactobacillus với 2 -3 chủng Vibriođể tuyển chọn sơ
bộ được các chủng có khả năng kháng. Tiếp theo sử dụng các chủng đã tuyển
chọn lần 1 để thử khả năng đối kháng với 3-4 chủng Vibrio, từ đó chọn ra các chủng có hoạt tính kháng mạnh để làm các bước tiếp theo.
2.2.3. Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa 2.2.3.1. Quan sát đặc điểm hình thái 2.2.3.1. Quan sát đặc điểm hình thái
Để xác định các đặc điểm hình thái tế bào, tiến hành làm tiêu bản giọt
ép, giọt treo, nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi.
2.2.3.2. Xác định đặc tính sinh hóa
Các chủng sau khi phân lập được xác định các đặc tính sinh hóa bao gồm
khả năng sinh acid lactic, khả năng lên men các loại đường, hoạt tính catalase
[24].
2.2.4. Xác định khả năng sinh trưởng
Các chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở
35oC, lắc 180 vòng/phút. Khả năng sinh trưởngđược xác định bằng phương pháp đo mật độ quang (OD620 nm) sau mỗi 3h nuôi cấy.
2.2.5. Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp - Nhiệt độ - Nhiệt độ
Các chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trưởng MRS lỏng, pH
6,5 ở các nhiệt độ 300, 350 và 400C, lắc vòng 180 vòng/phút. Lựa chọn nhiệt độ
thích hợp thông qua việc xác định khả năng sinh trưởng.
- pH môi trường
Các chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trưởng MRS lỏng với
các giá trị pH 3, 4, 5, 6, 7, 8 ở nhiệt độ đã chọn ở trên, lắc vòng 180 vòng/phút. pH thích hợpđược lựa chọn thông qua việc xác định khả năng sinh trưởng.