CHƯƠNG 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng quy trình phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm bằng phương pháp
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dị DAD
Hình 2.8: Quy trình phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD DAD
Thí nghiệm 1: Khảo sát bước sóng cực đại hấp thu bằng cách quét phổ UV-
Vis của NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD.
Mục đích: Chọn được bước sóng hấp thu cực đại của từng chất để thu được độ nhạy cao nhất khi phân tích.
Bố trí thí nghiệm: Chuẩn bị 10mL 3 dung dịch chuẩn NAA, NAAm và hỗn hợp NAA và NAAm khoảng 10µg/mL trong hỗn hợp ACN: HCOOH 0,2% (3:7) hoặc ACN : H2O (3:7) để tiêm vào thiết bị HPLC-DAD ở chế độ quét bước sóng từ 210nm – 600nm (sử dụng đèn D2 và đèn Wolfram).
Điều kiện thiết bị:
Máy sắc ký: HPLC Shimazdu
Xây dựng quy trình phân tích NAA và NAAm trên thiết bị
Khảo sát bước sóng cực đại hấp thu của các chất phân tích
Khảo sát thành phần pha động
Khảo sát tỷ lệ pha động
Khảo sát nhiệt độ cột
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Đầu dò: DAD (M20A)
Mẫu: NAA, NAAm 10µg/mL trong hỗn hợp pha động Cột tách: Chiralpak IG 150x4,6mm; 5µm
Tốc độ dịng: 1,0mL/phút Thể tích tiêm: 10µL Nhiệt độ phân tích: 30oC Thời gian phân tích: 30 phút Bước sóng: 210 – 600nm
Pha động: ACN: HCOOH 0,2% (3:7) và ACN : H2O (3:7) Ghi chú: Nếu thời gian lưu của chất gần 30 phút thì tiến hành rửa cột bằng cách nâng tỷ lệ dung môi lên đến 50% trong 3 phút và giữ 3 phút, sau đó đưa về điều kiện pha động phân tích trong 3 phút và chờ ổn định trong 5 phút rồi mới phân tích lần tiếp theo.
Tiêu chí đánh giá: Giá trị hấp thu cực đại theo biểu đồ hấp thu của mỗi chất.
Sau khi đã chọn được bước sóng tối ưu, thu hẹp bước sóng ở phần đầu dị, sau đó tiến hành khảo sát thành phần pha động, các thơng số phân tích khác giữ nguyên, chỉ thay đổi thành phần pha động.
Thí nghiệm 2: Khảo sát thành phần pha động.
Mục đích: Chọn được thành phần pha động tối ưu cho q trình phân tích
Hình 2.9: Khảo sát thành phần pha động tối ưu
Khảo sát thành phần pha động ACN : H2O (30:70) ACN : HCOOH 0,1% (30:70) ACN : HCOOH 0,2% (30:70) ACN : HCOOH 0,4% (30:70) ACN : HCOOH 0,8% (30:70) ACN : HCOOH 0,6% (30:70)
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Bố trí thí nghiệm: thực hiện tương tự thí nghiệm 1 chỉ thay đổi về thành phần pha động như hình vẽ, các điều kiện khác như sau:
Máy sắc ký: HPLC Shimazdu Đầu dò: DAD (M20A)
Mẫu: NAA, NAAm 10µg/mL trong hỗn hợp pha động Cột tách: Chiralpak IG 150x4,6mm; 5µm
Tốc độ dịng: 1,0mL/phút Thể tích tiêm: 10µL Nhiệt độ phân tích: 30oC
Thời gian phân tích: gấp 2 lần thời gian lưu hoặc 30 phút Bước sóng: Bước sóng tối ưu
Pha động: Như thí nghiệm 1
Tiêu chí đánh giá: Khả năng tách của pic thơng qua hệ số phân giải và hệ số kéo đi.
Thí nghiệm 3: Khảo sát tỷ lệ pha động
Mục đích: Thí nghiệm được dùng để xác định tỷ lệ thành phần dung mơi trong pha động.
Hình 2.10: Khảo sát tỷ lệ pha động tối ưu
Ghi chú: A là Acetontril và B là nồng độ acid formic đã tối ưu. Điều kiện thiết bị:
Máy sắc ký: HPLC Shimazdu Đầu dò: DAD (M20A)
Khảo sát tỷ lệ pha động A : B (10:90) A : B (20:80) A : B (30:70) A : B (40:60) A : B (50:50)
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Mẫu: NAA, NAAm 10µg/mL trong hỗn hợp pha động Cột tách: Chiralpak IG 150x4,6mm; 5µm
Tốc độ dịng: 1,0mL/phút Thể tích tiêm: 10µL Nhiệt độ phân tích: 30oC
Bước sóng: Điều kiện tối ưu Pha động: Theo bảng trên
Thời gian phân tích: gấp 2 lần thời gian lưu, nếu thời gian lưu lớn hơn 30 phút, thì nâng nồng độ dung môi bằng cách nâng tỷ lệ dung môi lên đến 50% trong 3 phút và giữ 3 phút, sau đó đưa về điều kiện pha động phân tích trong 3 phút và chờ ổn định trong 5 phút rồi mới phân tích lần tiếp theo. Khi thời gian phân tích lớn hơn 30 phút thì xem xét loại bỏ pha động này để dùng các pha động có thời gian lưu ngắn hơn. Tiêu chí đánh giá: Khả năng tách của pic thơng qua hệ số phân giải và hệ số kéo đuôi. Nếu mẫu tách ra nhau nhưng hệ số phân giải nhỏ hơn 2,0 thì tiếp tục điều chỉnh pha động từ 2 – 5% để có được thành phần pha động tối ưu với thời gian lưu ngắn và hệ số phân giải lớn hơn 2,0.
Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ cột
Mục đích: thí nghiệm được dùng để xác định nhiệt độ cột tối ưu trong quá trình tách NAA và NAAm.
Hình 2.11: Khảo sát nhiệt cột sắc ký lỏng
Khảo sát nhiệt độ cột HPLC
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Điều kiện thiết bị:
Máy sắc ký: HPLC Shimazdu
Mẫu: NAA, NAAm 10µg/mL trong hỗn hợp pha động Cột tách: Chiralpak IG 150x4,6mm; 5µm
Tốc độ dịng: 1,0mL/phút Thể tích tiêm: 10µL
Nhiệt độ phân tích: Theo bảng trên Thời gian phân tích: 30 phút
Bước sóng: điều kiện tối ưu Pha động: điều kiện tối ưu
Tiêu chí đánh giá: Độ tách của pic thơng qua hệ số phân giải và hệ số kéo đi.
Thí nghiệm 5: Khảo sát thể tích tiêm.
Mục đích: thí nghiệm được dùng để xác định thể tích tiêm mẫu tối ưu trong quá trình tách NAA và NAAm.
Hình 2.12: Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Điều kiện thiết bị:
Máy sắc ký: HPLC Shimazdu - DAD (M20A)
Mẫu: NAA, NAAm 10µg/mL trong hỗn hợp pha động Cột tách: Chiralpak IG 150x4,6mm; 5µm
Tốc độ dịng: 1,0mL/phút Thể tích tiêm: Theo bảng trên Thời gian phân tích: 30 phút
Bước sóng: điều kiện tối ưu Khảo sát thể tích tiêm mẫu
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Pha động: điều kiện tối ưu
Tiêu chí đánh giá: Thơng qua hệ số phân giải, hệ số kéo đi.
Thí nghiệm 6: Xây dựng đường chuẩn NAA, NAAm trên HPLC-DAD
Mục đích: Xác định phương trình tuyến tính NAA và NAAm.
Bố trí thí nghiệm: Pha các điểm chuẩn có nồng độ như sau: 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,2; 1; 5; 10; 20µg/mL. Trước tiên tiêm lặp lại 10 lần 1 lọ chuẩn 1µg/mL để xem xét tính ổn định của hệ thống bằng cách tính độ lệch chuẫn tương đối theo diện tích pic (RSD <2). Sau đó tiến hành tiêm các dung dịch chuẩn vào thiết bị HPLC-DAD với các điều kiện tối ưu. Tính tốn diện tích píc của chuẩn và xây dựng đường chuẩn.
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn NAA gốc: Cân 50mg NAA chính xác đến 0,1mg sau đó hịa tan trong hỗn hợp ACN : H2O (3:7) thành 50,0mL, (nồng độ dung dịch gốc khoảng 1000µg/mL). Bảo quản ở nhiệt độ 2–8oC trong 3 tháng.
Dung dịch chuẩn NAAm gốc: Cân 50mg NAAm chính xác đến 0,1mg sau đó hịa tan trong hỗn hợp ACN : H2O (3:7) thành 50,0mL, (nồng độ dung dịch gốc khoảng 1000µg/mL) . Bảo quản ở nhiệt độ 2–8oC trong 3 tháng.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (100µg/mL): Pha lỗng 1,0mL dung dịch chuẩn NAA và NAAm gốc thành 10,0mL bằng pha động. Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC trong 1 tuần.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 20µg/mL: Pha loãng 2,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian thành 100µg/mL thành 10,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 10µg/mL: Pha lỗng 1,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian thành 100µg/mL thành 10,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 5µg/mL: Pha lỗng 1,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian thành 100µg/mL thành 20,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Làm giàu mẫu
Mẫu táo đỏ đã sơ chế
Dung môi chiết
Kỹ thuật chiết
Thời gian chiết
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 1µg/mL: Pha lỗng 1,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian thành 100µg/mL thành 100,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,5µg/mL: Pha loãng 1,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 5µg/mL thành 10,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,1µg/mL: Pha lỗng 1,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 µg/mL thành 50,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,05µg/mL: Pha lỗng 1,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 5µg/mL thành 100,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,02 µg/mL: Pha lỗng 1,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 1µg/mL thành 50,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay sau khi pha.
Dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,01µg/mL: Pha lỗng 2,0mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,5µg/mL thành 100,0mL bằng pha động. Sử dụng ngay.