phân tích càng lớn, pic có thể bị kéo đi, làm cho giá trị độ phân giải (R) của hai chất phân tích bị giảm nhẹ (xem cơng thức 5 mục 2.4).
Bảng 3.3: Bảng kết quả độ phân giải và hệ số kéo đuôi khi thay đổi nhiệt độ buồng cột buồng cột
STT Nhiệt độ buồng cột (oC) Độ phân giải Hệ số kéo đuôi
NAA NAAm 1 30 2,745 1,090 1,087 2 35 2,765 1,084 1,081 3 40 2,776 1,083 1,082 4 45 2,751 1,090 1,089 5 50 2,727 1,097 1,097
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Nhiệt độ buồng cột càng tăng, khả năng tương tác của chất phân tích với pha tĩnh kém hơn do năng lượng dao động phân tử lớn làm pha vỡ các liên kết yếu với pha tĩnh, thời gian rửa giải nhanh hơn và pic ít bị kéo đi hơn. Sự thay đổi nhiệt độ từ 30 đến 50 không làm ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tách chất mà chỉ làm thay đổi thời gian rửa giải. Giá trị 40oC là nhiệt độ thực tế với điều kiện khí hậu Việt Nam cho quá trình phân tách hai chất phân tích.
3.1.5. Khảo sát thể tích tiêm mẫu.
Khi tăng thể tích tiêm mẫu làm tăng độ nhạy của phương pháp nhưng đồng thời cũng làm tăng hệ số kéo đi của pic chất phân tích, làm cho các chất phân tích dính vào nhau.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Khi tăng thể tích tiêm từ 10L lên 20L, kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về độ phân giải cũng như hệ số kéo đi (hình 3.10). Nếu tăng lên 30L thì độ phân giải và hệ số kéo đi thay đổi có sự khác biệt. Ngồi ra, khi tăng thể tích tiêm thì các chất tạp nhiễm và các thành phần khác quá lớn sẽ cạnh tranh tương tác vào pha tĩnh hoặc làm dơ cột phân tích. Khi sử dụng các thiết bị để phân tích, cần hạn chế tăng lượng mẫu vào thiết bị.
Hình 3.10: Độ phân giải của NAA và NAAm theo thể tích tiêm
Qua q trình khảo sát, khi tiêm thể tích mẫu 20L cho kết quả tối ưu về độ phân giải. Hệ số kéo đuôi là 1,083 và độ phân giải thu được là 2,776.
3.1.6. Xây dựng đường chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD
Bước cuối cùng của việc xây dựng phương pháp phân tích mẫu chuẩn là xác định độ ổn định của hệ thống và lập đường chuẩn để sử dụng cho các tính tốn. Tiến hành xác định độ ổn định của thiết bị bằng cách tiêm lặp lại 10 lần 1 dung dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 0,2g/mL vào hệ thống HPLC-DAD và tính tốn độ lệch chuẩn tương đối của nồng độ thu được. Kết quả thu được như sau
Bảng 3.4: Độ ổn định khi phân tích NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD qua 2 ngày khác nhau
STT Ngày 20/08/2020 Ngày 21/08/2020
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân 1 0,18661 0,20297 0,18709 0,20168 2 0,18597 0,20602 0,18711 0,20216 3 0,18736 0,20426 0,18750 0,20528 4 0,18500 0,19998 0,18654 0,20419 5 0,19183 0,20255 0,18693 0,19934 6 0,18881 0,20241 0,18904 0,20094 7 0,18856 0,20161 0,19314 0,20190 8 0,18748 0,20219 0,18850 0,20212 9 0,19231 0,20066 0,18483 0,20272 10 0,18659 0,20150 0,18739 0,20099 Trung bình (g/mL) 0,18805 0,20241 0,18781 0,20213 RSD (%) 1,278 0,860 1,162 0,828
Độ ổn định của thiết bị sau khi tiêm dung dịch NAA và NAAm có nồng độ 0,2g/mL 10 lần cho kết quả với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 2 (xem giá trị RSD% bảng 3.5). Giá trị này khẳng định thiết bị này ổn định cho việc phân tích 2 chất này.
Việc xây dựng giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện theo hướng học thuật phải đi từ việc thêm chuẩn các nồng độ khác nhau vào mẫu trắng, hoặc xây dựng đường chuẩn và suy ra giá trị LOD dự kiến, sau đó thêm chuẩn ở mức LOD dự kiến vào mẫu trắng và xem xét tính phù hợp của giá trị LOD dự kiến. Việc xác định theo hướng học thuật rất mất thời gian và chi phí. Hiện nay, các phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên mục đích là xác định hàm lượng các chất đó dựa vào các giới hạn tối đa cho phép của các tiêu chuẩn hoặc tổ chức. Giới hạn cho phép tối đa của NAA và NAAm trong táo đỏ theo châu Âu là 0,15mg/kg. Vì vậy, giới hạn định lượng của NAA và NAAm <0,15mg/kg là chấp nhận được (mỗi chất <0,075mg/kg). Vì vậy LOQ của phương pháp dự kiến là 0,06mg/kg mỗi chất là phù hợp phân tích mẫu thực tế, từ đó giá trị giới hạn phát hiện là 0,02mg/kg. Với giá trị 0,02mg/kg mỗi chất cần phân tích, lượng cân mẫu là 20g và thế tích cuối cùng sau khi xử lý là 5,0mL thì nồng độ chất phân tích trong dung dịch cuối là 0,08µg/mL mỗi chất phân tích. Như vậy, giá trị điểm chuẩn thấp nhất là 0,08µg/mL. Thơng thường giá trị nồng độ thấp
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân nhất đường chuẩn phải nhỏ hơn giá trị này nên cần xây điểm chuẩn rất thấp 0,01; 0,02 và 0,04 µg/mL. Nồng độ điểm chuẩn cao nhất là 20 µg/mL là do phương pháp sử dụng đầu dị thơng thường có độ tuyến tính nhỏ hơn 104 và nồng độ chất tăng trưởng này trong thực phẩm không quá lớn.
Tiếp theo, tiến hành lập đường chuẩn với 10 điểm chuẩn có nồng độ theo phụ lục 3 và phụ lục 4.
Hình 3.11: Đồ thị đường chuẩn NAA ngày 17-04-2020
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Từ diện tích pic chất phân tích của sắc đồ dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường chuẩn tuyến tính của nồng độ theo thể tích. Phương trình đường chuẩn tuyến tính của 2 chất tăng trưởng ngày 17-04-2020 lần lượt là:
NAA: y1 = 38049,5686*x1 + 0,4256 NAAm: y2 = 40327,6505*x2 + 0,9291
Trong đó y1, y2: lần lượt là diện tích của pic NAA và NAAm x1, x2: lần lượt là nồng độ của chuẩn NAA và NAAm
Tiếp theo, tiến hành lập đường chuẩn với 10 điểm chuẩn ngày 20-04-2020 có nồng độ theo phụ lục 5 và phụ lục 6 ta có đồ thị sau:
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Hình 3.14: Đồ thị đường chuẩn NAAm ngày 20-04-2020
Từ diện tích pic chất phân tích của sắc đồ dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường chuẩn tuyến tính của nồng độ theo thể tích. Phương trình đường chuẩn tuyến tính của 2 chất tăng trưởng ngày 20-04-2020 lần lượt là:
NAA: y1 = 38207,5426*x1 + 0,0217 NAAm: y2 = 39157,2782*x2 – 206,2902
Trong đó y1, y2: lần lượt là diện tích của pic NAA và NAAm x1, x2: lần lượt là nồng độ của chuẩn NAA và NAAm
Với hệ số hồi quy tuyến tính (R2) là 1,0000 lớn hơn 0,99; đường chuẩn này phù hợp cho việc tính tốn hàm lượng của 2 chất phân tích này trong q trình phân tích mẫu thực tế.
3.2.1. Khảo sát hàm lượng NAA và NAAm trong quả táo đỏ bằng phương
pháp HPLC-DAD
Khi chưa xác định được dung mơi hịa tan thích hợp thì cần xác định hàm lượng NAA và NAAm trong cả 3 loại dung môi cần khảo sát. Theo như hình 3.15, nồng độ chất cần phân tích trong táo đỏ xác định được nhỏ hơn 0,002mg/kg. Như vậy có thể kết luận khơng có NAA và NAAm trong táo đỏ
3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu táo đỏ dùng phân tích NAA và NAAm bằng thiết bị HPLC-DAD bằng thiết bị HPLC-DAD
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân NZ QUEEN theo phương pháp xử lý này. Vì vậy, khi tính tốn độ thu hồi cho các thí nghiệm sau, chỉ cần lấy giá trị hàm lượng chất phân tích xác định được chia cho hàm lượng chất phân tích thêm vào.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
3.2.2. Khảo sát thành phần dung môi chiết mẫu đến độ thu hồi NAA và
NAAm
Khảo sát độ thu hồi NAA và NAAm khi thêm chuẩn 1,2g/g vào mẫu táo đỏ với 3 loại dung môi: acid formic 1% trong dung môi ACN, acid formic 1% trong trong nước và dung môi ACN (50:50), acid formic 0,2% trong nước và dung môi ACN (72:28). Kết quả thu được như hình 3.16 và hình 3.17.
Hình 3.16: Độ thu hồi NAA khi thêm chuẩn 1,2g/g vào mẫu táo đỏ
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Nồng độ thêm chuẩn với chất NAA và NAAm là 1,2g/g, như vậy dung môi chiết là pha động cho kết quả độ thu hồi lần lượt là 82% và 90%. Với kết quả này phù hợp với yêu cầu về độ thu hồi theo AOAC năm 2016 phụ lục f (mức yêu cầu 80-110%). Dung môi ACN chứa 1% acid formic và dung môi ACN : HCOOH 1% (50:50) cho kết quả độ thu hồi tốt hơn và có giá trị tương đương nhau. Tuy nhiên do quy trình xử lý mẫu có cơng đoạn làm giàu mẫu bằng cô quay nên dung mơi thích hợp để lựa chọn chiết mẫu là ACN chứa 1% acid formic. Q trình cơ quay được diễn ra nhanh chóng và nhiệt độ cơ quay càng thấp thì thành phần dung mơi cơ quay cần hạn chế các chất có nhiệt độ bay hơi cao như là nước.
3.2.3. Khảo sát kỹ thuật chiết
Kỹ thuật chiết được khảo sát gồm vortex, siêu âm ở 30oC và 50oC
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Khi kiểm định tính đồng nhất thống kê giữa hai giá trị trung bình của NAA theo kỹ thuật vortex và siêu âm 30oC (phụ lục 10) ta có tthực nghiệm = -1,199 < tlý thuyết = 1,943. Như vậy hai giá trị trung bình này khác nhau không đáng kể ở mức α=0,05.
Khi kiểm định tính đồng nhất thống kê giữa hai giá trị trung bình của NAA theo kỹ thuật siêu âm 30oC và 50oC (phụ lục 11) ta có tthực nghiệm = -0,724 < tlý thuyết = 1,943. Như vậy hai giá trị trung bình này khác nhau khơng đáng kể ở mức α=0,05.
Hình 3.19: Độ thu hồi NAAm khi thêm chuẩn 1,2g/g với 3 kỹ thuật chiết
Việc vortex cần phải thao tác cẩn thận so với siêu âm, nhưng nồng độ chất phân tích thu được là thấp nhất. Tuy nhiên sự chênh lệch giữa 3 kỹ thuật chiết này là không lớn. Siêu âm tại nhiệt độ 30oC là đơn giản và hiệu quả cao nhất. Vì vậy kỹ thật chiết mẫu là siêu âm 30oC được sử dụng.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
3.2.4. Khảo sát thời gian chiết
Hình 3.20: Độ thu hồi NAA khi thêm chuẩn 1,2g/g thay đổi theo thời gian chiết chiết
Hình 3.21: Độ thu hồi NAAm khi thêm chuẩn 1,2g/g thay đổi theo thời gian chiết chiết
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Trong thí nghiệm này, thời gian chiết mẫu thay đổi từ 15 phút đến 90 phút, khả năng chiết mẫu cũng tăng dần và cao nhất ở 60 phút. Khi kiểm định giá trị trung bình của hai thời gian chiết mẫu cho thấy giá trị tthực nghiệm nhỏ hơn tlý thuyết (xem phụ lục 15 và 16) vì vậy độ thu hồi giữa các mức thời gian chiết là không khác biệt nhau có ý nghĩa. Vì sự khác biệt khơng có ý nghĩa này, để tiết kiệm thời gian và chi phí, thời gian chiết mẫu được chọn là 15 phút.
3.2.5. Kỹ thuật làm giàu mẫu
Kỹ thuật phân tích mẫu bằng đầu dị DAD (hoặc UV) có tính ổn định cao nhưng độ nhạy khơng cao, các mẫu cần phân tích ở nồng độ thấp cần được làm giàu mẫu để giá trị diện tích pic chất phân tích nằm trong đường chuẩn đã xây dựng. Trong đề tài này sử dụng cô quay để làm giàu chất phân tích. Nhiệt độ bay hơi của dung môi chiết mẫu acetonitril khoảng 82oC (ở áp suất 1atm) và chất lỏng truyền nhiệt trong cô quay là nước nên nhiệt độ cô quay khảo sát không cần đến 80oC. Việc sử dụng cô quay chân không làm giàu mẫu nên nhiệt độ bay hơi của dung môi sẽ giảm. Mức nhiệt độ cô quay thấp nhất được sử dụng để khảo sát là 50oC.
Hình 3.22: Độ thu hồi NAA khi thêm chuẩn vào mẫu táo đỏ với 3 kỹ thuật làm giàu mẫu giàu mẫu
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Hình 3.23: Độ thu hồi NAAm khi thêm chuẩn vào mẫu táo đỏ với 3 kỹ thuật làm giàu mẫu
Theo hình 3.22 và 3.23, độ thu hồi chất phân tích khi sử dụng cơ quay tại 50oC cho kết quả tương đối cao và sử dụng nhiệt độ cơ quay thấp sẽ thích hợp cho thực tế khi kiểm tra mẫu thử, mặc dù độ thu hồi của chất NAA thấp hơn 80%. Tuy nhiên, tại nhiệt độ 50oC với thiết bị hiện tại, không thể làm giàu mẫu về mức <5mL và thời gian cô quay mất hơn 30 phút, thể tích cơ quay còn lại khoảng 6-7mL dung dịch. Tại nhiệt độ 60oC, thể tích cơ quay cịn lại khoảng 4mL sau 30 phút. Ở nhiệt độ 70oC thời gian làm giàu mẫu còn 10 phút và mẫu thử còn <1mL, tuy nhiệt tại nhiệt độ 70oC có thể làm phân hủy mẫu nên kết quả thu hồi thấp nhất.
Với acetonitril tinh khiết, ở nhiệt độ 50oC, thời gian cô quay đến cạn là khoảng 5 phút. Như vậy các chất trong táo đã làm cho nhiệt độ bay hơi dung dịch mẫu thử tăng lên và không thể làm khô mẫu thử ở nhiệt độ <70oC. Thành phần nước và các loại đường trong táo đã làm tăng nhiệt độ bay hơi của mẫu thử. Đường là chất ảnh hưởng nhiều nhất đến nhiệt độ bay hơi của mẫu thử,
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân hàm lượng các loại đường trong mẫu thử phân tích được khoảng 12%, với hàm lượng đường fructose : sucrose : glucose lần lượt khoảng 6,5% : 3,6% : 1,6% (hình 3.24); kết quả này cũng tương ứng với kết quả của Karadeniz và Ekşi được công bố năm 2002 (Karadeniz and Ekşi, 2002). Vì vậy cần phải loại bỏ đường trước khi cô quay để làm giảm nhiệt độ bay hơi của mẫu thử.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Hình 3.24: Kết quả phân tích hàm lượng các loại đường trong mẫu táo và các phân lớp dung môi khi chiết mẫu
Theo tài liệu phân tích tồn dư thuốc bảo vệ thực vật có gốc acid của EU (EURL-SRM, 2015), mẫu chiết trong acetonitril có 1% acid formic được loại nước bằng cách thêm hỗn hợp MgSO4 và NaCl tỷ lệ 4:1, khi nước bị loại ra khỏi mẫu thì đường cũng bị loại theo do đường tan tốt trong nước và không tan trong dung môi acetonitril. Mẫu thử sau khi đã xử lý được nước và đường thì mẫu chỉ cần cô quay ở 60oC.
Cách xử lý mẫu như sau: cân 20g mẫu đã xay và đồng nhất vào ống ly tâm 50mL, thêm 30mL Acetonitril chứa 1% acid formic, siêu âm 15 phút ở 30oC, sau đó thêm 4g MgSO4 và 1g NaCl, vortex 30 giây. Ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch chiết cho vào erlen cổ nhám 150mL, thêm 15mL acetonitril chứa 1% acid formic vào ống ly tâm, vortex 30 giây, sau đó ly tâm với tốc độ và thời gian như trên. Lấy dịch chiết gộp vào bình erlen trên vào cơ quay ở điều kiện chân không và nhiệt độ 60oC đến khi dung dịch còn lại nhỏ hơn 1mL. Để nguội erlen và thêm 2mL pha động vào erlen, chuyển dung dịch
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân vào bình định mức 5mL, rửa erlen thêm lần nữa và chuyển vào bình định mức, định mức dung dịch đến vạch bằng pha động.
Hình 3.25: Khả năng tách lớp của muối MgSO4 và NaCl
Kết quả thu được như hình 3.26:
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Khi có hỗn hợp muối MgSO4 và NaCl, đường bị tách khỏi lớp trên. Khi thực hiện phân tích hàm lượng đường ở lớp trên, lớp dưới và dung dịch mẫu thử trước và sau khi thêm hỗn hợp muối. Hàm lượng đường fructose ở lớp trên