CHƯƠNG 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu táo đỏ dùng phân tích NAA và NAAm bằng
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dị DAD
Quy trình xử lý mẫu táo đỏ được khảo sát 4 yếu tố theo sơ đồ sau:
Sơ chế táo đỏ: Táo đỏ sau khi mua về được bỏ cuống, rửa sạch, sau đó rửa sạch bằng nước, cắt nhỏ, bỏ hạt. Mẫu cho vào cối xay, sử dụng máy xay mẫu tốc độ cao (hãng Philip, nấc số 2). Mẫu được tiến hành phân tích ngay hoặc bảo quản ở điều kiện -22oC đến khi được phân tích. Mẫu được rã đơng ở điều kiện nhiệt độ phòng (22 – 28oC) trong 3 giờ trước khi phân tích.
Hình 2.13: Quy trình khảo sát các yếu tố khi phân tích mẫu thực yếu tố khi phân tích mẫu thực
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Thí nghiệm 7: Khảo sát hàm lượng NAA và NAAm trong táo đỏ bằng
phương pháp HPLC-DAD.
Mục đích: Khảo sát hàm lượng NAA và NAAm trong táo đỏ để có sơ sở tính tốn độ thu hồi ở các thí nghiệm tiếp theo.
Bố trí thí nghiệm: Lấy 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50mL, thêm 30mL dung môi chiết. Tiến hành siêu âm ở nhiệt độ 30oC trong 30 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, cho phần dịch vào bình định mức 50mL và định mức đến vạch bằng dung môi chiết. Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào hệ thống sắc ký. Xác định hàm lượng NAA và NAAm trong mẫu thử.
Thay đổi dung môi chiết theo các nghiệm thức sau:
Nghiệm thức 1: ACN 100% có chứa 1% acid HCOOH
Nghiệm thức 2: ACN: H2O (50:50), có chứa 1% acid HCOOH Nghiệm thức 3: Pha động đã tối ưu.
Thí nghiệm 8: Khảo sát thành phần dung mơi chiết mẫu.
Mục đích: xác định loại dung mơi có khả năng chiết mẫu với độ thu hồi cao nhất.
Bố trí thí nghiệm: Lấy 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50mL, thêm 1,0mL hỗn hợp dung dịch chuẩn NAA và NAAm 10µg/mL trong nước (tương đương mức thêm chuẩn là 1µg/g), lắc bằng tay trong 1 phút và để yên 60 phút. Sau đó thêm 30mL dung dịch chiết. Tiến hành siêu âm ở nhiệt độ 30oC trong 30 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, cho phần dịch vào bình định mức 50mL và định mức đến vạch bằng dung môi chiết và định mức đến vạch bằng pha động. Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Thay đổi dung môi chiết theo các nghiệm thức sau:
Nghiệm thức 1: ACN 100% có chứa 1% acid HCOOH
Nghiệm thức 2: ACN: H2O (50:50), có chứa 1% acid HCOOH Nghiệm thức 3: Pha động đã tối ưu.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Tiêu chí đánh giá: Tính tốn hiệu suất thu hồi NAA và NAAm.
Thí nghiệm 9: Khảo sát kỹ thuật chiết
Mục đích: Xác định kỹ thuật chiết mẫu thích hợp
Bố trí thí nghiệm: Lấy 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50mL, thêm 1,0mL hỗn hợp dung dịch chuẩn NAA và NAAm 10µg/mL trong nước (tương đương mức thêm chuẩn là 1µg/g mẫu thử), lắc bằng tay trong 1 phút và để yên 60 phút. Sau đó thêm 30mL dung dịch chiết đã tối ưu. Tiến hành xử lý theo các nghiệm thức bên dưới trong 30 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, cho phần dịch vào bình định mức 50mL và định mức đến vạch bằng dung môi chiết và định mức đến vạch bằng dịch chiết đã tối ưu. Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Nghiệm thức 1: Chiết ở điều kiện thường, sau mỗi 10 phút tiến hành vortex 1 phút.
Nghiệm thức 2: Siêu âm ở 30oC Nghiệm thức 3: Siêu âm ở 50oC
Tiêu chí đánh giá: Tính tốn hiệu suất thu hồi NAA và NAAm.
Thí nghiệm 10: Khảo sát thời gian chiết
Mục đích: Xác định thời gian chiết mẫu thích hợp
Bố trí thí nghiệm: Lấy 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50mL, thêm 1,0mL hỗn hợp dung dịch chuẩn NAA và NAAm 10µg/mL trong nước (tương đương mức thêm chuẩn là 1µg/g), lắc bằng tay trong 1 phút và để yên 60 phút. Sau đó thêm 30mL dung dịch chiết đã tối ưu. Tiến hành xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết đã tối ưu theo thời gian thay đổi từ 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, cho phần dịch vào bình định mức 50mL và định mức đến vạch bằng dung môi chiết và định mức đến vạch bằng pha động. Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào hệ thống sắc ký.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Thí nghiệm 11: Khảo sát các kỹ thuật làm giàu mẫu phân tích
Mục đích: Xác định kỹ thuật làm giàu mẫu giữa cô quay chân không ở các nhiệt độ bay hơi mẫu
Bố trí thí nghiệm: Lấy 20g mẫu cho vào ống ly tâm 50mL, thêm 1,0mL hỗn hợp dung dịch chuẩn NAA và NAAm 20µg/mL trong nước (tương đương mức thêm chuẩn là 1µg/g), lắc bằng tay trong 1 phút và để yên 60 phút. Sau đó thêm 30mL dung dịch chiết đã tối ưu. Tiến hành xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết và thời gian đã tối ưu. Sau đó ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy phần dịch phía trên cơ quay chân khơng (chỉnh áp suất phù hợp để mẫu không bị sôi, nhiệt độ làm lạnh là 5,0oC) trong điều kiện nhiệt độ 50, 60, 70oC. Sau khi dịch cơ quay cịn khoảng 1mL, để nguội, sau đó hịa tan và định mức trong 5,0mL pha động. Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Tiêu chí đánh giá: Tính tốn hiệu suất thu hồi NAA và NAAm.
Thí nghiệm 12: Phân tích mẫu táo đỏ trên thiết bị HPLC-DAD
Mục đích: Xác định hàm lượng NAA và NAAm trên mẫu táo đỏ cho mục đích tính tốn độ thu hồi ở mức thấp.
Bố trí thí nghiệm: Xử lý mẫu 20g mẫu theo điều kiện đã tối ưu trên thiết bị HPLC-DAD. Mẫu sau khi xử lý được tiêm vào hệ thống HPLC-DAD.
Thí nghiệm 13: Xác định hiệu suất thu hồi NAA và NAAm trên mẫu táo đỏ
thêm chuẩn ở mức thêm chuẩn 0,06mg/kg.
Mục đích: Tính tốn hiệu suất thu hồi để biết được phương pháp phân tích có khả năng phân tích mẫu thực hay khơng.
Bố trí thí nghiệm: Lấy 20g mẫu cho vào ống ly tâm 50mL, thêm 1mL hỗn hợp dung dịch chuẩn NAA và NAAm ở mức nồng độ là 1,2µg/mL cho mỗi chất trong nước (tương đương mức thêm chuẩn là 0,06mg/kg mẫu thử), lắc bằng tay trong 1 phút và để yên 60 phút. Sau đó thêm 30 mL dung dịch chiết đã tối ưu. Tiến hành xử lý mẫu theo điều kiện tối ưu. Lọc qua màng lọc 0,45µm và tiêm vào hệ thống sắc ký HPLC-DAD.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Hình 2.14: Quy trình xác định hiệu xuất thu hồi NAA và NAAm trên mẫu táo
Tiêu chí đánh giá: hiệu suất thu hồi phải nằm trong mức cho phép (mức thêm chuẩn 0,06mg/kg có hiệu suất thu hồi trong khoảng 80 – 110%).