CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng phương pháp phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị
3.1.3. Khảo sát tỷ lệ pha động
Thành phần pha động và tỷ lệ pha động là yếu tố quyết định của q trình tách các chất phân tích khi qua cột sắc ký.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ pha động ACN : HCOOH 0,2% (10:90) cho thời gian phân tích quá dài, thời gian phân tích 30 phút nhưng chưa có chất nào được rửa giải ra khỏi cột phân tích. Do đó, pha động này khơng thích hợp để phân tích hai chất này (hình 3.3).
Hình 3.3: Sắc ký đồ khảo sát NAA và NAAm với tỷ lệ dung môi 1:9
Khảo sát pha động ACN : HCOOH 0,2% (20:80) được xem là thành phần tốt nhất cho việc phân tách NAA và NAAm so với 4 loại tỷ lệ pha động còn lại. Tỷ lệ pha động ACN : HCOOH 0,2% (50:50) có giá trị phân tách tốt 1,964 (>1,5), nhưng giá trị hệ số kéo đi lớn hơn. Ngồi ra, khi các chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột phân tích quá sớm làm cho pic của NAA và NAAm nằm trong các pic tạp nhiễu khác khơng tương tác với cột phân tích, dẫn đến việc phân tích thường gặp sai số dương. Ở tỷ lệ 50:50 này, thứ tự rửa giải chất phân tích cũng bị đảo ngược so với tỷ lệ 30:70, làm cho chất phân tích NAA ra trước NAAm. Sự đảo ngược thời gian lưu là do tương tác giữa chất phân tích với cột phân tích là gần bằng nhau nhưng do nhóm carboxylic của NAA tương tác mạnh với pha
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân động là acetonitril hơn nhóm amino-carboxylic của NAAm nên NAA bị rửa giải trước. Tuy nhiên, độ tách của hai chất cũng gần nhau do cấu trúc và độ phân cực không chệch lệch lớn.
Tỷ lệ pha động ACN : HCOOH 0,2% (40:60) khơng có khả năng tách hai chất này và làm diện tích pic tăng lên.
Bảng 3.2: Bảng kết quả độ phân giải và hệ số kéo đuôi giữa các tỷ lệ pha động
STT Tên tỷ lệ pha động Độ phân giải Hệ số kéo đuôi
NAA NAAm 1 ACN : HCOOH 0,2% (10:90) - - - 2 ACN : HCOOH 0,2% (20:80) 6,609 1,087 1,090 3 ACN : HCOOH 0,2% (30:70) 1,367 1,078 1,085 4 ACN : HCOOH 0,2% (40:60) 0 1,006 5 ACN : HCOOH 0,2% (50:50) 1,964 1,243 1,196 6 ACN : HCOOH 0,2% (28:72) 2,745 1,090 1,087
Khi xem xét lại giá trị độ phân giải của hai chất NAA và NAAm, giá trị trung bình của pha động ACN : HCOOH 0,2% (20:80) là 6,609, vì vậy cần thực hiện tối ưu hóa thành phần pha động. Có thể nhận thấy, khi tối ưu hóa tỷ lệ pha động thì tỷ lệ pha động tối ưu phải nằm giữa pha động có số thứ tự thứ 2 và thứ 3 của bảng 3.2. Từ đó lập phương trình tuyến tính với x là giá trị tỷ lệ pha động 20%, 30% và y là giá trị độ phân giải 6,609; 1,367, khi đó phương trình thu được là y = ˗ 0,5242x + 17,093. Chọn giá trị độ phân giải bằng y=2,5 (vì yêu cầu cần độ phân giải > 2 và do các yếu tố thực tế có thể khơng tuyến tính nên chọn giá trị 2,5) thì giá trị nồng độ acetonitril x= 27,8% làm tròn thành 28%. Như vậy, pha động ACN : HCOOH 0,2% (28:72) để khảo sát tiếp tục nhằm giảm thời gian phân tích và tiết kiệm chi phí.
Khảo sát này cho kết quả khả quan với độ phân giải 2,745 (>1,5) và hệ số kéo đuôi được thu lại với giá trị trung bình là 1,09 (hình 3.4). Như vậy pha động này thích hợp để phân tích hai chất điều hòa sinh trưởng NAA và NAAm.
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn ở điều kiện tỷ lệ pha động tối ưu