CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng phương pháp phân tích mẫu chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị
3.1.6. Xây dựng đường chuẩn NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD
Bước cuối cùng của việc xây dựng phương pháp phân tích mẫu chuẩn là xác định độ ổn định của hệ thống và lập đường chuẩn để sử dụng cho các tính tốn. Tiến hành xác định độ ổn định của thiết bị bằng cách tiêm lặp lại 10 lần 1 dung dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 0,2g/mL vào hệ thống HPLC-DAD và tính tốn độ lệch chuẩn tương đối của nồng độ thu được. Kết quả thu được như sau
Bảng 3.4: Độ ổn định khi phân tích NAA và NAAm trên thiết bị HPLC-DAD qua 2 ngày khác nhau
STT Ngày 20/08/2020 Ngày 21/08/2020
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân 1 0,18661 0,20297 0,18709 0,20168 2 0,18597 0,20602 0,18711 0,20216 3 0,18736 0,20426 0,18750 0,20528 4 0,18500 0,19998 0,18654 0,20419 5 0,19183 0,20255 0,18693 0,19934 6 0,18881 0,20241 0,18904 0,20094 7 0,18856 0,20161 0,19314 0,20190 8 0,18748 0,20219 0,18850 0,20212 9 0,19231 0,20066 0,18483 0,20272 10 0,18659 0,20150 0,18739 0,20099 Trung bình (g/mL) 0,18805 0,20241 0,18781 0,20213 RSD (%) 1,278 0,860 1,162 0,828
Độ ổn định của thiết bị sau khi tiêm dung dịch NAA và NAAm có nồng độ 0,2g/mL 10 lần cho kết quả với độ lệch chuẩn tương đối nhỏ hơn 2 (xem giá trị RSD% bảng 3.5). Giá trị này khẳng định thiết bị này ổn định cho việc phân tích 2 chất này.
Việc xây dựng giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện theo hướng học thuật phải đi từ việc thêm chuẩn các nồng độ khác nhau vào mẫu trắng, hoặc xây dựng đường chuẩn và suy ra giá trị LOD dự kiến, sau đó thêm chuẩn ở mức LOD dự kiến vào mẫu trắng và xem xét tính phù hợp của giá trị LOD dự kiến. Việc xác định theo hướng học thuật rất mất thời gian và chi phí. Hiện nay, các phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên mục đích là xác định hàm lượng các chất đó dựa vào các giới hạn tối đa cho phép của các tiêu chuẩn hoặc tổ chức. Giới hạn cho phép tối đa của NAA và NAAm trong táo đỏ theo châu Âu là 0,15mg/kg. Vì vậy, giới hạn định lượng của NAA và NAAm <0,15mg/kg là chấp nhận được (mỗi chất <0,075mg/kg). Vì vậy LOQ của phương pháp dự kiến là 0,06mg/kg mỗi chất là phù hợp phân tích mẫu thực tế, từ đó giá trị giới hạn phát hiện là 0,02mg/kg. Với giá trị 0,02mg/kg mỗi chất cần phân tích, lượng cân mẫu là 20g và thế tích cuối cùng sau khi xử lý là 5,0mL thì nồng độ chất phân tích trong dung dịch cuối là 0,08µg/mL mỗi chất phân tích. Như vậy, giá trị điểm chuẩn thấp nhất là 0,08µg/mL. Thơng thường giá trị nồng độ thấp
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân nhất đường chuẩn phải nhỏ hơn giá trị này nên cần xây điểm chuẩn rất thấp 0,01; 0,02 và 0,04 µg/mL. Nồng độ điểm chuẩn cao nhất là 20 µg/mL là do phương pháp sử dụng đầu dị thơng thường có độ tuyến tính nhỏ hơn 104 và nồng độ chất tăng trưởng này trong thực phẩm không quá lớn.
Tiếp theo, tiến hành lập đường chuẩn với 10 điểm chuẩn có nồng độ theo phụ lục 3 và phụ lục 4.
Hình 3.11: Đồ thị đường chuẩn NAA ngày 17-04-2020
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân Từ diện tích pic chất phân tích của sắc đồ dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường chuẩn tuyến tính của nồng độ theo thể tích. Phương trình đường chuẩn tuyến tính của 2 chất tăng trưởng ngày 17-04-2020 lần lượt là:
NAA: y1 = 38049,5686*x1 + 0,4256 NAAm: y2 = 40327,6505*x2 + 0,9291
Trong đó y1, y2: lần lượt là diện tích của pic NAA và NAAm x1, x2: lần lượt là nồng độ của chuẩn NAA và NAAm
Tiếp theo, tiến hành lập đường chuẩn với 10 điểm chuẩn ngày 20-04-2020 có nồng độ theo phụ lục 5 và phụ lục 6 ta có đồ thị sau:
HVTH: Phạm Minh Tiến GVHD: TS. Lâm Văn Mân
Hình 3.14: Đồ thị đường chuẩn NAAm ngày 20-04-2020
Từ diện tích pic chất phân tích của sắc đồ dung dịch chuẩn, tiến hành xây dựng đường chuẩn tuyến tính của nồng độ theo thể tích. Phương trình đường chuẩn tuyến tính của 2 chất tăng trưởng ngày 20-04-2020 lần lượt là:
NAA: y1 = 38207,5426*x1 + 0,0217 NAAm: y2 = 39157,2782*x2 – 206,2902
Trong đó y1, y2: lần lượt là diện tích của pic NAA và NAAm x1, x2: lần lượt là nồng độ của chuẩn NAA và NAAm
Với hệ số hồi quy tuyến tính (R2) là 1,0000 lớn hơn 0,99; đường chuẩn này phù hợp cho việc tính tốn hàm lượng của 2 chất phân tích này trong q trình phân tích mẫu thực tế.