Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.5. Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ và kỹ thuật sử dụng trong nghiờn cứu
2.5.3. Quy trỡnh xột nghiệm khỏng tiểucầu
Làm xột nghiệm khỏng thể khỏng tiểu cầu giỏn tiếp tại Viện Huyết học và Truyền mỏu Trung ương bằng kỹ thuật flow cytometry.
2.5.3.1. Nguyờn lý xột nghiệm
HLA và khỏng nguyờn nhúm mỏu ABO. Trong những điều kiện nhất định, cú thể cú thể sinh cỏc tự khỏng thể chống lại cỏc khỏng nguyờn tiểu cầu của chớnh mỡnh (bệnh giảm tiểu cầu miễn dịch) hoặc sinh khỏng thể đồng loại chống cỏc khỏng nguyờn tiểu cầu truyền vào (khi được truyền tiểu cầu người). Cỏc khỏng thể khỏng tiểu cầu này một phần gắn vào bề mặt tiểu cầu, một phần tồn tại tự do trong huyết tương. Bản chất của khỏng thể này là IgG.
Dựng khỏng thể đơn dũng gắn huỳnh quang khỏng IgG người cú thể phỏt hiện được khỏng thể khỏng tiểu cầu giỏn tiếp (khỏng thể tự do trong huyết tương) bằng kỹ thuật đếm tế bào dũng chảy (flowcytometry).
Nguyờn tắc đếm tế bào dũng chảy là đo độ tỏn xạ và/hoặc huỳnh quang của tế bào trong cửa sổ điện tử được ghi lại trờn biểu đồ. Biểu đồ thể hiện mối tưng quan giữa tỏn xạ trước hay cũn gọi là tỏn xạ gúc vuụng (Side Scatter: SS) với tỏn xạ bờn hay cũn gọi là tỏn xạ gúc hẹp (Forward Scatter: FS) của ỏnh sỏng. Biểu đồ được sử dụng để hỗ trợ cho giai đoạn khoanh vựng (gating stage).
Phõn tớch sự phỏt huỳnh quang của cỏc tế bào (đó được phõn tỏch) nhằm giỳp phõn biệt cỏc tế bào nhuộm dương tớnh với cỏc tế bào khụng nhuộm. Cỏc kết quả được biểu thị dưới dạng phần trăm của tế bào nhuộm dương tớnh trờn tổng số tế bào khoanh vựng được.
Hỡnh 2.3 Minh họa giản đồ cho thấy mối quan hệ của tỏn xạ ỏnh sỏng và kớch thước/cấu trỳc tế bào
2.5.3.2. Phương tiện
- Mỏy phõn tớch tế bào dũng chảy FACSCanto II; - Mỏy ly tõm;
- Mỏy lắc trộn (mỏy votex);
- Pipet và đầu pipet cỏc loại 250 và 1.000 microlit; - Cỏc ống nghiệm chuyờn dụng cho flow cytometry; - Găng tay làm xột nghiệm.
Hỡnh 2.4. Mỏy phõn tớch tế bào dũng chảy FACSCanto II; 2.5.3.3. Húa chất 2.5.3.3. Húa chất
- Anti CD61-PE;
- Anti human IgG-FITC; - Anti human IgM-FITC; - Dung dịch PBS-EDTA;
- Dung dịch sheath chạy mỏy flow;
- Nước cất, húa chất khử trựng Natri hypoclorite;
- Mẫu chứng õm: là mẫu huyết thanh người khụng cú khỏng thể khỏng tiểu cầu; - Mẫu chứng dương: là mẫu huyết thanh người cú khỏng thể khỏng tiểu cầu; - 5 mẫu tiểu cầu của người cho mỏu cựng nhúm ABO với người bệnh.
2.5.3.4. Mẫu bệnh phẩm (mẫu thai phụ)
Mỏu toàn phần:
- Lấy 2ml vào ống khụng chất chống đụng.
- Gửi mẫu ngay lờn phũng xột nghiệm để tỏch huyết thanh bằng cỏch ly tõm 3000 vũng/phỳt x5 phỳt
+Hỳt lớp huyết thanh ra ống nghiệm đó ghi đầy đủ thụng tin (mỗi ống 300àl).
+ Sau đú bảo quản huyết thanh thai phụ ở 20C-80C.
+ Huyết thanh thai phụ được bảo quản dõy chuyền lạnh chuyển đến Viện Huyết học và Truyền mỏu Trung ương để làm xột nghiệm khỏng thể khỏng tiểu cầu theo phương phỏp giỏn tiếp.
2.5.3.5. Chọn mẫu làm chứng
- Tiểu cầu nhúm mỏu O
+ Lấy từ mỏu của người khỏe mạnh: theo tiờu chuẩn của người hiến mỏu- tại điều 4 thụng tư 26/2013TT-BYT.
+ Lấy 3 ống mỏu chống đụng Natri Citrat 3.8% hoặc 3.2% của người hiến tiểu cầu nhúm mỏu O khỏc nhau hoặc cú thể sử dụng 3 cuống tiểu cầu nhúm O từ 3 đơn vị tiểu cầu khỏc nhau.
+ Tiểu cầu O cú thể xin ba cuống tiểu cầu mỏy hoặc tiểu cầu pool tại kho mỏu hoặc phỏt mỏu.
- Huyết thanh chứng õm (huyết thanh AB)
+ Huyết thanh chứng õm được lấy từ mỏu của người khỏe mạnh: theo tiờu chuẩn của người hiến mỏu-tại điều 4 thụng tư 26/2013TT-BYT.
+ Huyết thanh AB được khoa sản xuất cung cấp và được chia nhỏ bảo quản tủ lạnh -200C.
2.5.3.6. Quy trỡnh thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị
- Pha PBS EDTA,formandehyde theo cụng thức.
- Ghi tờn bệnh nhõn, năm sinh lờn 2 ống nghiệm xanh 12x75mm (dựng cho mỏy Flow cytometry Navios),hoặc 2 ống nghiệm trắng 12x75mm(dựng cho mỏy Flow cytometry BD canto).
- Lập hồ sơ xột nghiệm khỏng thể khỏng tiểu cầu giỏn tiếp theo biểu mẫu. Bước 2: Tỏch huyết thanh
- Ly tõm bệnh nhõn, năm sinh lờa bệnh nhõn và mẫu chứng nhúm AB tốc độ tõm (3000vũng/phỳt)x5phỳt.
- Hỳt lớp huyết thanh ra ống nghiệm đó ghi đầy đủ thụng tin (mỗi ống 300àl).
Bước 3: Tỏch tiểu cầu O
- Ghi tờn mẫu tiểu cầu bỡnh thường (nhúm O) lờn ống falcol 15ml.
- Đổ 3 ống mỏu chống đụng người bỡnh thường (nhúm mỏu O) vào falcol 15ml.
- Ly tõm ống chống đụng của bệnh nhõn tốc độ (500vũng/phỳt) x 10phỳt. - Hỳt lớp huyết tương giàu tiểu cầu ra ống nghiệm flow sạch đó ghi đầy đủ thụng tin.
- Nếu sử dụng cuống tiểu cầu O thỡ cắt cuống tiểu cầu nhỏ tiểu cầu vào ống nghiệm flow sạch.
Bước 4: Đếm tiểu cầu và pha loóng tiểu cầu
- Đếm số lượng tiểu cầu bệnh nhõn bằng buồng đếm hoặc mỏy đếm tế bào. - Pha loóng tiểu cầu của bệnh nhõn để được nồng độ tiểu cầu 106 tế bào/ml.
Bước 5: Cố định tế bào
- Hỳt vào hai ống flow đó ghi ở trờn ống 1 và ống 2 mỗi ống 100àl tiểu cầu O nồng độ 106/ml và 100àl formaldehyde 2% ủ trong 10 phỳt nhiệt độ phũng.
- Thờm 2ml PBS EDTA vào mỗi ống ly tõm 3000vũng/phỳt lặp lại bước này 2 lần.
Bước 6: Ủ tiểu cầu với huyết thanh
Ống 1 Ống 2
Thờm vào ống cú sẵn tiểu cầu đó cố định:
+ 300àl huyết thanh bệnh nhõn. + Vortex, ủ trong tối nhiệt độ phũng 45 phỳt.
Thờm vào ống cú sẵn tiểu cầu đó cố định:
+ Thờm 300àl huyết thanh AB (người bỡnh thường)
+Vortex, ủ trong tối nhiệt độ phũng 45 phỳt.
Bước 7: Rửa
- Thờm 2ml dung dịch PBS EDTA, vontex ly tõm 3000vũng/1phỳt trong 10 phỳt, bỏ dịch nổi thu cặn.
- Lặp lại 1 lần bước rửa. Bước 8: Ủ khỏng thể
- Thờm 20àl Mouse anti Human IgG (FITC) và 20àl CD61 hoặc CD 41 vào cả 2 ống.
- Vontex 1và 20nti Human Ig trong tối 20 phỳt. - Bự 100àl PBS EDTA vào cả hai ống 1 và ống 2.
Bước 9: Chạy mỏy
- Lập sơ đồ vị trớ mẫu xột nghiệm - Chạy mỏy Navios (Beckman colter):
- Kiểm tra mỏy, bật mỏy và chuẩn mỏy: theo Quy trỡnh vận hành, bảo dưỡng mỏy Flow cytometry Navios (QT.MD.07).
- Chọn chương trỡnh làm việc: Mở Navios/ Dr Lee/Protocols/khang the khang TC/chạy mỏy theo sơ đồ vị trớ mẫu.
- Rửa mỏy và tắt mỏy: theo Quy trỡnh vận hành, bảo dưỡng mỏy Flow cytometry Navios (QT.MD.07).
Bước 10: Phõn tớch kết quả
- Phõn tớch kết quả trờn phần mền, in kết quả vừa phõn tớch.
- Nhập kết quả vào trương trỡnh Labconn theo quy trỡnh trả kết quả QT.MD.40.
- Hoàn thành hồ sơ lưu kết quả của bệnh nhõn.
2.5.3.7. Biện luận kết quả
- CD41 nhận ra glycoprotein GpIIb (chuỗi integrin alpha IIb), là thành phần liờn kết khụng cộng húa trị với GpIIIa (chuỗi integrin beta 3)tạo phức hợi GpIIb/IIIa.
- CD61 nhận ra glycoprotein GpIIIa (chuỗi integrin beta 3) của màng tiểu cầu.
- Hỡnh 1, mẫu mỏu bỡnh thường, tiểu cầu được chọn dựa vào FS (Forward Scatter) và SS (Side Scatter). Hỡnh 2, tiểu cầu được nhuộm với CD41 (GpIIb) và CD61 (GpIIIa) và cho biểu hiện cả 2 glycoprotein.
Hỡnh 2.5. FS và SS tiểu cầu
- Dựa vào MFI (Mean fluo resscent Intensity): - Đồ thị và bảng tớnh kết quả
- Tiờu chuẩn dương tớnh là mean ống 1 (ống thử)/mean ống 2 (ống chứng) ≥1,3.
- Tiờu chuẩn õm tớnh là mean ống 1 (ống thử)/mean ống 2 (ống chứng)<1,3.
Hỡnh 2.6. MFI (Mean fluo resscent Intensity)
Chỉ số mean Quần thể
Vớ dụ:
+ Trường hợp dương tớnh:
Phương phỏp Ống Chỉ số mean Tỷ lệ mean(ống 1/ống 2) Kết quả
Giỏn tiếp Ống 1 C C/D≥1.3 DƯƠNG TÍNH Ống 2 D + Trường hợp õm tớnh:
Phương phỏp Ống Chỉ số mean Tỷ lệ mean(ống 1/ống 2) Kết quả
Giỏn tiếp Ống 1 C C/D<1.3 ÂM
TÍNH
Ống 2 D
2.5.3.8. Tiờu chuẩn đỏnh giỏ và kiểm tra chất lượng
+ Khi tỏch tiểu cầu để làm xột nghiệm phải loại bỏ hết hồng cầu và bạch cầu. + Mẫu õm tớnh và mẫu tiểu cầu O được lấy từ người hiến tiểu cầu (người khỏe mạnh cú số lượng tiểu cầu bỡnh thường và chưa từng truyền tiểu cầu).
+ Dựa vào SS và FS để đỏnh giỏ và phỏt hiện quần thể tiểu cầu. + Ống nghiệm để làm xột nghiệm phải sạch.
+ Lượng khỏng thể và tế bào phải tương đủ. + Húa chất phải cũn hạn sử dụng