2.2.1. Thời gian nghiờn cứu
Thời gian nghiờn cứu từ thỏng 3 năm 2014 đến thỏng 12 năm 2018.
2.2.2. Địa điểm nghiờn cứu
Khoa Huyết học-Truyền mỏu bệnh viện Bạch Mai, viện Huyết học- Truyền mỏu Trung ương và bệnh viện Phụ sản Trung ương.
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu 2.3.1. Thiết kế nghiờn cứu 2.3.1. Thiết kế nghiờn cứu
2.3.2. Cỡ mẫu nghiờn cứu
Chọn mẫu cú chủ đớch, lấy cỏc thai phụ đủ tiờu chuẩn lựa chọn và loại trừ trong thời gian nghiờn cứu. Trờn thực tế chỳng tụi chọn được 58 thai phụ và 58 trẻ sơ sinh được sinh ra bởi 58 thai phụ này đưa vào nghiờn cứu theo dừi.
2.3.3. Cỏc bước thu thập số liệu
+ Lựa chọn thai phụ đủ tiờu chuẩn đưa vào nghiờn cứu và thu thập số liệu theo mẫu phiếu nghiờn cứu.
+ Tất cả cỏc thai phụ được hỏi bệnh, tiền sử và thăm khỏm lõm sàng; sau đú được chỉ định xột nghiệm (cụng thức mỏu, miễn dịch (nếu cần)) và nhận định kết quả xột nghiệm trong lần khỏm đầu tiờn, theo chỉ định chuyờn khoa huyết học và ngay trước khi sinh.
+ Kết hợp chuyờn khoa huyết học theo dừi, điều trị cho thai phụ. Quyết định thời điểm, biện phỏp dừng thai nghộn.
+ Theo dừi hậu sản: nguy cơ chảy mỏu; xột nghiệm lại cụng thức mỏu trong thời gian hậu sản tại bệnh phũng.
+ Kết hợp sơ sinh thăm khỏm lõm sàng đỏnh giỏ tỡnh trạng sơ sinh, chỉ định làm xột nghiệm cụng thức mỏu trong vũng 24 giờ sau sinh, xỏc định cú xuất huyết hay khụng, nếu cần chỉ định siờu õm xuyờn thúp.
+ Hẹn khỏm lai sau sinh theo chuyờn khoa huyết học (xột nghiệm cụng thức mỏu kiểm tra số lượng tiểu cầu trong 08 tuần sau sinh khi số lượng tiểu cầu <150G/l hoặc khi số lượng tiểu cầu đó về 150G/l trước 08 tuần sau sinh).
2.4. Cỏc biến số, chỉ số nghiờn cứu
2.4.1. Một số đặc điểm chung về đối tượng nghiờn cứu
+ Tuổi của thai phụ: phõn theo cỏc nhúm tuổi sau: <18 tuổi; 18-34 tuổi; ≥35 tuổi (vị thành niờn, thành niờn, mẹ lớn tuổi).
+ Nghề nghiệp: Cỏn bộ cụng chức, cụng nhõn, nụng dõn, nghề khỏc. + Số lần mang thai: 1 lần, ≥2 lần (con so, con rạ).
+ Tiền sử giảm tiểu cầu ở những lần mang thai trước: khụng, cú.
+ Thời điểm phỏt hiện giảm tiểu cầu: ≤14 tuần; 15-< 28 tuần; ≥28 tuần; lỳc chuyển dạ đẻ (quý 1, quý 2, quý 3 thai kỳ theo quy định khỏm thai).
2.4.2. Đặc điểm lõm sàng, cận lõm sàng, nguyờn nhõn của thai phụ bị giảm tiểu cầu. giảm tiểu cầu.
+ Đặc điểm xuất huyết: Khụng cú triệu chứng xuất huyết/xuất huyết dưới da (nhẹ)/xuất huyết niờm mạc (trung bỡnh)/xuất huyết nội tạng (nặng).
+ Thời điểm xuất huyết tại cỏc thời điểm: - Khi vào viện
- Trước khi kết thỳc thai nghộn - Sau khi kết thỳc thai nghộn - Khi ra viện
+ Tỡnh trạng thiếu mỏu, giảm tiểu cầu tại cỏc thời điểm: - Trước khi kết thỳc thai nghộn
- Trước khi ra viện (trong thời gian điều trị hậu phẫu hoặc hậu sản tại viện).
+ Số lượng tiểu cầu thai phụ lỳc phỏt hiện
+ Số lượng tiểu cầu thai phụ lỳc sinh
+ Khỏng thể khỏng tiểu cầu ở thai phụ: Âm tớnh, dương tớnh
Phõn nhúm thai phụ trước sinh: GT (số lượng tiểu cầu ≥80G/l và khỏng thể õm tớnh) và ITP (số lượng tiểu cầu <80G/l hoặc/và khỏng thể dương tớnh).
+ Tỡnh trạng thiếu mỏu ở thai phụ
+ Tỡnh trạng khỏm lại sau sinh:cú/khụng (theo chuyờn khoa huyết học).
2.4.3. Đỏnh giỏ một số chỉ số huyết học của trẻ sơ sinh được sinh ra bởi những thai phụ bị giảm tiểu cầu những thai phụ bị giảm tiểu cầu
+ Tuổi thai khi sinh + Cõn nặng khi sinh
+ Số lượng tiểu cầu của sơ sinh: <50G/l; 50–100G/l; >100G/l
Phõn nhúm thai phụ sau sinh GT: tiểu cầu sơ sinh ≥150G/l
ITP: tiểu cầu sơ sinh <150G/l + Khỏng thể khỏng tiểu cầu ở sơ sinh: Âm tớnh/dương tớnh.
2.4.4. Thỏi độ xử trớ đối với thai phụ giảm tiểu cầu
+Phương phỏp mổ lấy thai: đẻ thường, đẻ mổ, đẻ thủ thuật (theo WHO [86] khi số lượng tiểu cầu >80G/l chỉ định mổ lấy thai hoàn toàn do bỏc sĩ sản khoa quyết định).
+ Phương phỏp giảm đau: Gõy tờ, gõy mờ (chỉ nờn gõy tờ vựng khi số lượng tiểu cầu <80G/l) [87].
+ Phương phỏp điều trị nội khoa: - Corticoid
- Truyền gamma globulin - Truyền tiểu cầu
- Phối hợp cỏc phương phỏp trờn.
2.5. Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ và kỹ thuật sử dụng trong nghiờn cứu 2.5.1. Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ 2.5.1. Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ
+ Tuổi thai: Phõn loại tuổi thai theo WHO (2021):
- Sinh non: 22- <37 tuần.
- Thai gần đủ thỏng và đủ thỏng: 37- <41 tuần. - Thai quỏ ngày: ≥ 42 tuần. + Tuổi thai: Phõn loại tuổi thai theo thời điểm khỏm thai:
- Qỳy 1: ≤14 tuần - Qỳy 2: 15-<28 tuần - Qỳy 3: ≥ 28 tuần
+ Phõn loại thiếu mỏu theo lượng huyết sắc tố: theo phõn độ thiếu mỏu ở thai phụ của World Health Organization classification.
- Khụng thiếu mỏu : ≥110g/l - Thiếu mỏu độ 1 : 80- <110g/l - Thiếu mỏu độ 2 : 60- <80g/l - Thiếu mỏu độ 3 : <60g/l.
+ Phõn loại mức độ giảm tiểu cầu: Phõn độ giảm tiểu cầu theo Guideline for the management of Thrombocytopenia in pregnancy (GL927).
- Nhẹ : 100-150G/l - Trung bỡnh : 50- <100G/l - Nặng : 20- <50G/l - Rất nặng : <20G/l.
+ Phõn nhúm sau khi cú đầy đủ dữ liệu của 58 thai phụ và 58 sơ sinh được sinh ra bởi cỏc thai phụ này:
- Giảm tiểu cầu thai nghộn (GT) được đặc trưng bởi: số lượng tiểu cầu giảm nhẹ (theo cỏc bỏo cỏo số lượng tiểu cầu thường ở mức 80-150G/l) [24], [25]; khụng cú triệu chứng và xảy ra trong ba thỏng cuối của thai kỳ; khụng cú tiền sử giảm tiểu cầu (trừ trường hợp cú thai trước đú), khụng tỡm được khỏng thể khỏng tiểu cầu. Nú khụng gõy ra biến chứng của mẹ, thai nhi hoặc trẻ sơ sinh. Số lượng tiểu cầu trở về bỡnh thường sau sinh [27].
- Giảm tiểu cầu tự miễn (ITP): được gợi ý nghĩ đến khi số lượng tiểu cầu <80G/l hoặc cú khỏng thể khỏng tiểu cầu hoặc cú giảm tiểu cầu ở trẻ sơ sinh.
2.5.2. Xột nghiệm đếm số lượng tiểu cầu [88]
Số lượng tiểu cầu được đếm trong dung dịch cũn giữa nguyờn cả hồng cầu, bạch cầu.
Hiện nay thường đếm số lượng tiểu cầu bằng mỏy phõn tớch huyết học, trong trường hợp nghi ngờ bất thường sẽ đếm lại số lượng bằng kớnh hiển vi.
Kỹ thuật đếm tiểu cầu bằng mỏy phõn tớch huyết học tự động:
Nguyờn tắc cơ bản là trở khỏng. Nguyờn lý cơ bản của mỏy đếm tế bào theo dũng điện là sự biến đổi điện trở khi tế bào đi qua điện trường tạo thành cỏc xung dũng điện. Nguyờn lý này giỳp phõn tớch sự khỏc biệt về kớch thước cỏc loại tế bào khỏc nhau.
Tiểu cầu được đếm trong dung dịch cũn giữa nguyờn cả hồng cầu, bạch cầu.
Mỏu xột nghiệm, hoỏ chất và dụng cụ:
- Mẫu bệnh phẩm là 2ml mỏu tĩnh mạch được chống đụng bằng EDTA K2/K3.
- Dụng cụ lấy mỏu mao mạch (đầu ngún tay) và tĩnh mạch. - Dung dịch amoni oxalat hoặc dung dịch Marcano.
- Quả búp cao su.
- Mỏy phõn tớch huyết học tự động sysmex XT-2000i và húa chất đi kốm.
Kỹ thuật đếm tiểu cầu bằng mỏy
Mỏu được pha trong dung dịch pha loóng, dung dịch này là chất dẫn điện tốt; cỏc tế bào mỏu là những vật thể ớt dẫn điện. Một dũng điện ổn định được tạo ra cho hỗn hợp dịch cú tế bào mỏu giữa hai điện cực ở hai phớa của một lỗ nhỏ mà cỏc tế bào mỏu cần đếm sẽ chạy qua. Mỗi tế bào mỏu khi di chuyển qua lỗ nhỏ tạo nờn một xung điện tương đương với số lượng tế bào mỏu đó đi qua trong một khoảng nhất định. Độ lớn của mỗi xung điện tỷ lệ thuận với thể tớch của tế bào mỏu, tiểu cầu được xỏc định bằng tổng số cỏc tế bào mỏu cú thể tớch trong khoảng 2-24 fl.
Hỡnh 2.2. Cấu trỳc cơ bản của mỏy đo lưu lượng cho thấy hệ thống vận chuyển chất lỏng, hệ thống quang học, hệ thống điện tử và mỏy phõn loại
2.5.3. Quy trỡnh xột nghiệm khỏng tiểu cầu
Làm xột nghiệm khỏng thể khỏng tiểu cầu giỏn tiếp tại Viện Huyết học và Truyền mỏu Trung ương bằng kỹ thuật flow cytometry.
2.5.3.1. Nguyờn lý xột nghiệm
HLA và khỏng nguyờn nhúm mỏu ABO. Trong những điều kiện nhất định, cú thể cú thể sinh cỏc tự khỏng thể chống lại cỏc khỏng nguyờn tiểu cầu của chớnh mỡnh (bệnh giảm tiểu cầu miễn dịch) hoặc sinh khỏng thể đồng loại chống cỏc khỏng nguyờn tiểu cầu truyền vào (khi được truyền tiểu cầu người). Cỏc khỏng thể khỏng tiểu cầu này một phần gắn vào bề mặt tiểu cầu, một phần tồn tại tự do trong huyết tương. Bản chất của khỏng thể này là IgG.
Dựng khỏng thể đơn dũng gắn huỳnh quang khỏng IgG người cú thể phỏt hiện được khỏng thể khỏng tiểu cầu giỏn tiếp (khỏng thể tự do trong huyết tương) bằng kỹ thuật đếm tế bào dũng chảy (flowcytometry).
Nguyờn tắc đếm tế bào dũng chảy là đo độ tỏn xạ và/hoặc huỳnh quang của tế bào trong cửa sổ điện tử được ghi lại trờn biểu đồ. Biểu đồ thể hiện mối tưng quan giữa tỏn xạ trước hay cũn gọi là tỏn xạ gúc vuụng (Side Scatter: SS) với tỏn xạ bờn hay cũn gọi là tỏn xạ gúc hẹp (Forward Scatter: FS) của ỏnh sỏng. Biểu đồ được sử dụng để hỗ trợ cho giai đoạn khoanh vựng (gating stage).
Phõn tớch sự phỏt huỳnh quang của cỏc tế bào (đó được phõn tỏch) nhằm giỳp phõn biệt cỏc tế bào nhuộm dương tớnh với cỏc tế bào khụng nhuộm. Cỏc kết quả được biểu thị dưới dạng phần trăm của tế bào nhuộm dương tớnh trờn tổng số tế bào khoanh vựng được.
Hỡnh 2.3 Minh họa giản đồ cho thấy mối quan hệ của tỏn xạ ỏnh sỏng và kớch thước/cấu trỳc tế bào
2.5.3.2. Phương tiện
- Mỏy phõn tớch tế bào dũng chảy FACSCanto II; - Mỏy ly tõm;
- Mỏy lắc trộn (mỏy votex);
- Pipet và đầu pipet cỏc loại 250 và 1.000 microlit; - Cỏc ống nghiệm chuyờn dụng cho flow cytometry; - Găng tay làm xột nghiệm.
Hỡnh 2.4. Mỏy phõn tớch tế bào dũng chảy FACSCanto II; 2.5.3.3. Húa chất
- Anti CD61-PE;
- Anti human IgG-FITC; - Anti human IgM-FITC; - Dung dịch PBS-EDTA;
- Dung dịch sheath chạy mỏy flow;
- Nước cất, húa chất khử trựng Natri hypoclorite;
- Mẫu chứng õm: là mẫu huyết thanh người khụng cú khỏng thể khỏng tiểu cầu; - Mẫu chứng dương: là mẫu huyết thanh người cú khỏng thể khỏng tiểu cầu; - 5 mẫu tiểu cầu của người cho mỏu cựng nhúm ABO với người bệnh.
2.5.3.4. Mẫu bệnh phẩm (mẫu thai phụ)
Mỏu toàn phần:
- Lấy 2ml vào ống khụng chất chống đụng.
- Gửi mẫu ngay lờn phũng xột nghiệm để tỏch huyết thanh bằng cỏch ly tõm 3000 vũng/phỳt x5 phỳt
+Hỳt lớp huyết thanh ra ống nghiệm đó ghi đầy đủ thụng tin (mỗi ống 300àl).
+ Sau đú bảo quản huyết thanh thai phụ ở 20C-80C.
+ Huyết thanh thai phụ được bảo quản dõy chuyền lạnh chuyển đến Viện Huyết học và Truyền mỏu Trung ương để làm xột nghiệm khỏng thể khỏng tiểu cầu theo phương phỏp giỏn tiếp.
2.5.3.5. Chọn mẫu làm chứng
- Tiểu cầu nhúm mỏu O
+ Lấy từ mỏu của người khỏe mạnh: theo tiờu chuẩn của người hiến mỏu- tại điều 4 thụng tư 26/2013TT-BYT.
+ Lấy 3 ống mỏu chống đụng Natri Citrat 3.8% hoặc 3.2% của người hiến tiểu cầu nhúm mỏu O khỏc nhau hoặc cú thể sử dụng 3 cuống tiểu cầu nhúm O từ 3 đơn vị tiểu cầu khỏc nhau.
+ Tiểu cầu O cú thể xin ba cuống tiểu cầu mỏy hoặc tiểu cầu pool tại kho mỏu hoặc phỏt mỏu.
- Huyết thanh chứng õm (huyết thanh AB)
+ Huyết thanh chứng õm được lấy từ mỏu của người khỏe mạnh: theo tiờu chuẩn của người hiến mỏu-tại điều 4 thụng tư 26/2013TT-BYT.
+ Huyết thanh AB được khoa sản xuất cung cấp và được chia nhỏ bảo quản tủ lạnh -200C.
2.5.3.6. Quy trỡnh thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị
- Pha PBS EDTA,formandehyde theo cụng thức.
- Ghi tờn bệnh nhõn, năm sinh lờn 2 ống nghiệm xanh 12x75mm (dựng cho mỏy Flow cytometry Navios),hoặc 2 ống nghiệm trắng 12x75mm(dựng cho mỏy Flow cytometry BD canto).
- Lập hồ sơ xột nghiệm khỏng thể khỏng tiểu cầu giỏn tiếp theo biểu mẫu. Bước 2: Tỏch huyết thanh
- Ly tõm bệnh nhõn, năm sinh lờa bệnh nhõn và mẫu chứng nhúm AB tốc độ tõm (3000vũng/phỳt)x5phỳt.
- Hỳt lớp huyết thanh ra ống nghiệm đó ghi đầy đủ thụng tin (mỗi ống 300àl).
Bước 3: Tỏch tiểu cầu O
- Ghi tờn mẫu tiểu cầu bỡnh thường (nhúm O) lờn ống falcol 15ml.
- Đổ 3 ống mỏu chống đụng người bỡnh thường (nhúm mỏu O) vào falcol 15ml.
- Ly tõm ống chống đụng của bệnh nhõn tốc độ (500vũng/phỳt) x 10phỳt. - Hỳt lớp huyết tương giàu tiểu cầu ra ống nghiệm flow sạch đó ghi đầy đủ thụng tin.
- Nếu sử dụng cuống tiểu cầu O thỡ cắt cuống tiểu cầu nhỏ tiểu cầu vào ống nghiệm flow sạch.
Bước 4: Đếm tiểu cầu và pha loóng tiểu cầu
- Đếm số lượng tiểu cầu bệnh nhõn bằng buồng đếm hoặc mỏy đếm tế bào. - Pha loóng tiểu cầu của bệnh nhõn để được nồng độ tiểu cầu 106 tế bào/ml.
Bước 5: Cố định tế bào
- Hỳt vào hai ống flow đó ghi ở trờn ống 1 và ống 2 mỗi ống 100àl tiểu cầu O nồng độ 106/ml và 100àl formaldehyde 2% ủ trong 10 phỳt nhiệt độ phũng.
- Thờm 2ml PBS EDTA vào mỗi ống ly tõm 3000vũng/phỳt lặp lại bước này 2 lần.
Bước 6: Ủ tiểu cầu với huyết thanh
Ống 1 Ống 2
Thờm vào ống cú sẵn tiểu cầu đó cố định:
+ 300àl huyết thanh bệnh nhõn. + Vortex, ủ trong tối nhiệt độ phũng 45 phỳt.
Thờm vào ống cú sẵn tiểu cầu đó cố định:
+ Thờm 300àl huyết thanh AB (người bỡnh thường)
+Vortex, ủ trong tối nhiệt độ phũng 45 phỳt.
Bước 7: Rửa
- Thờm 2ml dung dịch PBS EDTA, vontex ly tõm 3000vũng/1phỳt trong 10 phỳt, bỏ dịch nổi thu cặn.
- Lặp lại 1 lần bước rửa. Bước 8: Ủ khỏng thể
- Thờm 20àl Mouse anti Human IgG (FITC) và 20àl CD61 hoặc CD 41 vào cả 2 ống.
- Vontex 1và 20nti Human Ig trong tối 20 phỳt. - Bự 100àl PBS EDTA vào cả hai ống 1 và ống 2.
Bước 9: Chạy mỏy
- Lập sơ đồ vị trớ mẫu xột nghiệm - Chạy mỏy Navios (Beckman colter):
- Kiểm tra mỏy, bật mỏy và chuẩn mỏy: theo Quy trỡnh vận hành, bảo dưỡng mỏy Flow cytometry Navios (QT.MD.07).
- Chọn chương trỡnh làm việc: Mở Navios/ Dr Lee/Protocols/khang the khang TC/chạy mỏy theo sơ đồ vị trớ mẫu.
- Rửa mỏy và tắt mỏy: theo Quy trỡnh vận hành, bảo dưỡng mỏy Flow cytometry Navios (QT.MD.07).
Bước 10: Phõn tớch kết quả
- Phõn tớch kết quả trờn phần mền, in kết quả vừa phõn tớch.
- Nhập kết quả vào trương trỡnh Labconn theo quy trỡnh trả kết quả QT.MD.40.
- Hoàn thành hồ sơ lưu kết quả của bệnh nhõn.
2.5.3.7. Biện luận kết quả
- CD41 nhận ra glycoprotein GpIIb (chuỗi integrin alpha IIb), là thành phần liờn kết khụng cộng húa trị với GpIIIa (chuỗi integrin beta 3)tạo phức hợi GpIIb/IIIa.
- CD61 nhận ra glycoprotein GpIIIa (chuỗi integrin beta 3) của màng tiểu cầu.
- Hỡnh 1, mẫu mỏu bỡnh thường, tiểu cầu được chọn dựa vào FS (Forward Scatter) và SS (Side Scatter). Hỡnh 2, tiểu cầu được nhuộm với CD41 (GpIIb) và CD61 (GpIIIa) và cho biểu hiện cả 2 glycoprotein.
Hỡnh 2.5. FS và SS tiểu cầu
- Dựa vào MFI (Mean fluo resscent Intensity): - Đồ thị và bảng tớnh kết quả
- Tiờu chuẩn dương tớnh là mean ống 1 (ống thử)/mean ống 2 (ống chứng) ≥1,3.
- Tiờu chuẩn õm tớnh là mean ống 1 (ống thử)/mean ống 2 (ống chứng)<1,3.
Hỡnh 2.6. MFI (Mean fluo resscent Intensity)
Chỉ số mean Quần thể
Vớ dụ:
+ Trường hợp dương tớnh:
Phương phỏp Ống Chỉ số mean Tỷ lệ mean(ống 1/ống 2) Kết quả
Giỏn tiếp Ống 1 C C/D≥1.3 DƯƠNG TÍNH Ống 2 D + Trường hợp õm tớnh:
Phương phỏp Ống Chỉ số mean Tỷ lệ mean(ống 1/ống 2) Kết quả
Giỏn tiếp Ống 1 C C/D<1.3 ÂM
TÍNH
Ống 2 D
2.5.3.8. Tiờu chuẩn đỏnh giỏ và kiểm tra chất lượng
+ Khi tỏch tiểu cầu để làm xột nghiệm phải loại bỏ hết hồng cầu và bạch cầu. + Mẫu õm tớnh và mẫu tiểu cầu O được lấy từ người hiến tiểu cầu (người