2.4. Enzym hemicellulase: 2.4.1 Định nghĩa:
- Hemicellulase là enzym thủy phân, xúc tác thủy giải hemicellulose. Hemicellulase thủy giải các liên kết ß-glycoside như ß-1,6; ß-1,3 hay ß-1,4- glycoside trong phân tử.[9]
2.4.2 Cơ chất:
- Hemicellulose là cơ chất của enzym hemicellulase. Hemicellulose được cấu tạo từ các loại đường khác nhau, các gốc nầy được nối với nhau bằng liên kết β -1,3; β -1,4; β -1,6 glycoside. Hemicellulose thường tồn tại ở dạng mạch ngắn, phân nhánh. Hemicellulose cĩ ở thành tế bào rau quả nhưng kém bền hơn cellulose. Khác với cellulose, hemicellulose vừa là vật liệu cấu trúc vỏ tế bào vừa là nguyên liệu dự trữ năng lượng cho các quá trình trao đổi chất trong rau quả. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các monosacchride như manose, galactose, xylose hay arabinose. [9,16]
2.4.3 Phân loại:
- Trong thực vật thì xylan là loại hemicellulose thường gặp nhất. Xylan là 1 polysaccharid dị thể, mạch chính được cấu tạo bởi các đơn vị D-glucose nối nhau bằng liên kết 1,4-ß-xylopyranosyl, mạch nhánh liên kết với arabinose, acid glucuronic hay acid arabinoglucuronic. Vì vậy để thủy phân hồn tồn xylan phải cĩ sự phối hợp hoạt động của nhiều enzym khác nhau. Và chỉ cĩ riêng xylanase là tác động lên mạch chính của xylan.[16]
- Các enzym tham gia vào quá trình phân cắt xylan:
+ Xylanase (EC 3.2.1.8) hay endo-ß-1,4-xylanase thuộc nhĩm enzym thủy phân, là enzym phân cắt xylan do thủy giải liên kết 1,4-ß-xylopyranosyl trong xylan.[16]
+ ß-xylosidase (EC 3.2.1.37): Enzym nầy cĩ khả năng thủy phân xylobiose và xylooligosacchride. ß-xylosidase khơng phân cắt được xylan nhưng lại cĩ thể thủy phân p-nitrophenyl-ß-D-xylopyranoside.[32]
+ α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.31): Enzym nầy cĩ tính đặc hiệu cao về cơ chất, chỉ phân cắt liên kết giữa 4-O-methylglucuronic và xylooligosacchride, cĩ hoạt tính thấp trên các polymer glucuronoxylan. Enzym nầy hoạt động hiệu quả khi cĩ sự phối hợp với xylanase và ß-xylosidase.
+ α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55): Đây là exo-enzym cĩ khả năng phân cắt liên kết α-1,3-arabinofuranoside từ các đơn vị xylopyranoxyl trên chuỗi xylooligosaccharide và xylan.[16]
+ Acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.72): Enzym thủy phân liên kết ester trên xylan. Enzym tác động lên các nhĩm acetyl trên polymer xylan và cĩ thể khử acetyl trên cơ chất tự nhiên một cách nhanh chĩng. Enzym nầy đĩng vai trị quan trọng trong việc thủy phân xylan vì khi nhĩm acetyl bị phân cách, các enzym khác sẽ dễ dàng tấn cơng mạch chính của phân tử xylan.[32]
2.5 Một số nghiên cứu mới về cơng nghệ sản xuất nước carrot và ứng dụng enzym thủy phân trong cơng nghệ nầy: enzym thủy phân trong cơng nghệ nầy:
2.5.1 Cơng nghệ sản xuất nước carrot:
2.5.1.1 Nghiên cứu sử dụng phương pháp trường điện từ cao áp (High voltage electrostatic field _ HVEF) trong sản xuất nước carrot để kéo dài voltage electrostatic field _ HVEF) trong sản xuất nước carrot để kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm:
- Sản phẩm nước carrot trong quá trình bảo quản thường cĩ hiện tượng chuyển thành màu nâu, đồng thời độ đục, lượng carotenoid giảm. Hiện tượng đổi màu nâu là do phản ứng Maillard, sự khử acid ascorbic và sự chuyển hĩa tanin. Đã cĩ nhiều nghiên cứu để khắc phục những vấn đề trên. Gần đây, Chang-Wei Hsieh và Wen-Ching Ko (2008), đã sử dụng phương pháp xử lý sản phẩm bằng trường điện từ cao áp (HVEF) kết hợp bảo quản lạnh (R-group). Phương pháp giúp kéo dài thời gian bảo quản và sản phẩm cĩ chất lượng tốt hơn khi so với phương pháp bảo quản lạnh thơng thường ở 40C.[45]
- Trong 12 ngày bảo quản, nhĩm sản phẩm đối chứng cĩ độ đục giảm từ 0.38 NTU(nephelometric turbidity units) xuống 0.18 NTU trong khi đối với nhĩm sản phẩm thí nghiệm, độ đục chỉ giảm xuống 0.21 NTU. Như vậy phương pháp xử lý sản phẩm bằng trường điện từ cao áp sẽ giúp ổn định độ đục của sản phẩm tốt hơn đồng thời vẫn giữ được các đặc tính nước carrot trong quá trình bảo quản.[45]
- Trong 15 ngày bảo quản, hàm lượng carotenoid từ 83.4 μg/g giảm xuống 22.2 μg/g (đối với sản phẩm đối chứng) và giảm cịn 32.73 μg/g (đối với sản phẩm thí nghiệm). Hàm lượng carotenoid giảm trong thời gian bảo quản cĩ thể do ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ, ánh sáng... Mặc dù hàm lượng carotenoid trong hai nhĩm sản phẩm đều giảm nhưng phương pháp xử lý bằng điện trường cao áp làm cho hàm lượng của chúng ít giảm hơn.[45]
- Theo các tác giả Alwazeer, Cachon Divies (2002) thì nấm men
Saccharomyces là tác nhân chủ yếu làm hỏng nước carrot. Khi xử lý nước carrot
bằng trường điện từ cao áp thì lượng vi sinh vật trong sản phẩm sẽ tăng chậm hơn so với mẫu đối chứng trong thời gian 12 ngày bảo quản ở 40C.[45]
- Như vậy kết hợp giữa hai phương pháp xử lý bằng trường điện từ cao áp với phương pháp bảo quản lạnh sẽ cĩ tác dụng duy trì chất lượng nước ép carrot tốt hơn trong thời gian lưu trữ.[45]
2.5.1.2 Sử dụng xung điện trong quy trình thu nhận nước carrot để làm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết: tăng hiệu suất thu hồi chất chiết:
- Nước carrot thường được sản xuất theo quy trình rửa (washing:W) và ép (pressing: P), gọi tắt là W-P hay quy trình ép-rửa-ép (gọi là P-W-P). Nhằm làm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết, người ta sử dụng thêm các phương pháp xử lý nguyên liệu như chần, gia nhiệt, dùng xung điện (pulsed electric field: PEF), chất hĩa học (NaOH, Na2CO3) hay chế phẩm enzym. Nghiên cứu của Nabil Grimi và cộng sự (2007) cho thấy phương pháp dùng xung điện PEF cĩ khả năng làm phân hủy mơ quả rất cao nên sẽ làm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết từ carrot và các loại trái cây khác.[60]
- Khi sử dụng phương pháp PEF vào quy trình W-P để thu nhận nước carrot sẽ giúp gia tăng hàm lượng dịch bào, độ brix, hàm lượng carotenoid. Kích thước mẫu carrot trong quá trình xử lý khơng quá nhỏ, kết quả đạt tốt nhất đối với mẫu carrot cĩ chiều dài 30mm, chiều rộng 2mm và chiều cao 7mm. [60]
2.5.1.3 Ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt đến quá trình chuyển hĩa dạng cis-trans của β−carotene trong sản phẩm nước carrot: dạng cis-trans của β−carotene trong sản phẩm nước carrot:
- Quá trình sản xuất nước carrot trải qua nhiều quá trình gia nhiệt như chần, ép, thanh trùng pasteur hoặc tiệt trùng. Đây là những nguyên nhân làm biến đổi các thành phần cis-trans carotene trong sản phẩm.
- Nghiên cứu của Michaela Marx, Monicka Stuparic, Andreas Schieber, Reinhold Carle (2003) đã khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ chần (800, 900, 1000 C) và thời gian chần (10 phút, 30 phút, 60 phút) đến sự chuyển hĩa trans- cis-β-carotene trong sản phẩm nước carrot. Trong quy trình sản xuất, sản phẩm được mang tiệt trùng ở 1210C trong 5 phút hoặc thanh trùng ở 950C trong 30 giây.[59]
- Kết quả chính thu được như sau:
+ Nếu chần carrot trước khi chà ở 800C trong 10 phút, sau đĩ thanh trùng sản phẩm ở 950C, 30 giây hoặc tiệt trùng ở 1210C trong 5 phút thì khơng cĩ sự chuyển hĩa isomer. Khi thanh trùng thì thành phần 13-cis-β-carotene trong sản phẩm chiếm 2%. Cịn khi tiệt trùng thì thành phần 13-cis-β-carotene trong sản phẩm chiếm 5%. Nếu bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ 200C thì cĩ một lượng nhỏ trans-cis-β-carotene bị chuyển hĩa.[59]
+ Chần carrot ở nhiệt độ 900, 1000C trong các khoảng thời gian 10 phút, 30 phút, 60 phút thì sẽ cĩ sự chuyển hĩa dạng trans-cis isomer của β-carotene. Nếu nhiệt độ chần carrot càng cao thì trong quá trình bảo quản sản phẩm, mức độ isomer hĩa sẽ tăng lên. Tuy nhiên, thực tế thời gian chần trong cơng nghiệp khơng vượt quá 10 phút. Dạng 13-cis-β-carotene luơn xuất hiện trong sản phẩm ở tất cả các nghiệm thức khảo sát. Và khi nhiệt độ tăng cao thì sự chuyển hĩa 13-cis-β-carotene sẽ tăng theo.[59]
+ Kéo dài thời gian tiệt trùng ở 1210C từ 5 phút đến 40 phút khơng ảnh hưởng thành phần β-carotene tổng số, khơng gia tăng hàm lượng 13-cis-β- carotene trong sản phẩm. Nhưng khi tiệt trùng ở 1300C sẽ làm gia tăng sự chuyển hĩa trans-cis-isomer, hàm lượng 13-cis-β-carotene tăng từ 7.85 đến 12.35%, 9-cis-β-carotene được hình thành với hàm lượng 2.3% - 2.7%.[59]
2.5.1.4 Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng amino acid trong nước carrot cơ đặc trong quá trình bảo quản: cơ đặc trong quá trình bảo quản:
- Các nghiên cứu nhận thấy rằng, trong quá trình bảo quản nước rau quả cũng như nước carrot, sản phẩm bị chuyển sang màu nâu. Sự chuyển màu sản phẩm khơng phải do enzym xúc tác mà là do phản ứng Maillard giữa nhĩm α- NH2và nhĩm đường khử. Do đĩ hàm lượng amino acid bị mất đi.[53]
- Buedo và cộng sự (2001) nhận thấy rằng hàm lượng amino acid tổng số trong nước carrot cơ đặc giảm lần lượt là 8%, 35%, 60% sau 112 ngày lưu trữ ở 150C, 300C, 370C.[53]
- Hou-Jin Wang (2006) đã nghiên cứu sự biến đổi amino acid trong nước carrot cơ đặc với 200, 400, 600 brix được lưu trữ ở 00C, 250C, 370C.[53]
- Kết quả cho thấy: Sau 6 tháng lưu trữ ở 370C, hàm lượng tổng amino acid trong sản phẩm nước carrot cơ đặc 20, 40 và 600brix giảm 72.9%, 70.1%, 78.3% trong khi đĩ nếu bảo quản ở 250C thì tổng lượng amino acid của 3 mẫu trên chỉ giảm 48.7%, 42.6% và 48.5%. Như vậy nhiệt độ bảo quản thấp sẽ hạn chế sự giảm hàm lượng amino acid so với nhiệt độ cao.[53]
2.5.1.5 Nghiên cứu sử dụng các phụ gia để làm giảm độ đục, độ nhớt và các chất cặn trong nước carrot: các chất cặn trong nước carrot:
- Nước carrot dễ bị đục trong quá trình lưu trữ. Nguyên nhân cĩ thể là do cặn từ phần thịt carrot (pulp sediment: PS) và chất cặn trắng (white sediment: WS). Tác giả Chulin Liang và cộng sự (2006) đã nghiên cứu hiệu quả sử dụng phụ gia trong việc ổn định độ đục và độ nhớt của nước carrot. Các phụ gia nghiên cứu là guar (GA), xanthan (XA), sodium carboxymethyl cellulose (CMC) và gellan (GE). Kết quả cho thấy khi thêm 0.2g/100ml GU, 0.2g/100ml XA, 0.3g/100ml CMC hoặc phối trộn 0.015g/100ml với 0.1g/100ml XA vào nước carrot sẽ làm giảm lượng PS và WS nhưng chất cặn PS và WS vẫn xuất hiện sau 60 ngày lưu trữ. Tuy nhiên sử dụng 0.02g/100ml GE cĩ thể ngăn ngừa sự xuất
hiện PS và WS, làm giảm độ nhớt và độ đục sản phẩm. Do đĩ GE là chất ổn định thích hợp của nước carrot.[46]
2.5.2 Nghiên cứu ứng dụng enzym trong quy trình sản xuất nước carrot.
- Hiện nay trong cơng nghệ sản xuất nước rau quả thường sử dụng chế phẩm enzym. Cĩ thể sử dụng hỗn hợp enzym hay từng loại enzym riêng lẻ. Điều đĩ tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu hay sản phẩm tạo thành. Khi sử dụng chế phẩm enzym trong sản xuất nước quả sẽ cĩ tác dụng:[9]
+ Tăng hiệu suất trích ly dịch quả do tác động phá vỡ thành tế bào thực vật, làm lỏng lẻo cấu trúc của thành tế bào, từ đĩ giải phĩng vật chất cĩ trong tế bào tốt hơn.[9]
+ Khi dùng enzym pectinase, các hệ keo của nước quả sẽ bị phá hủy hồn tồn thành chất hịa tan, do đĩ sản phẩm sẽ giảm độ nhớt, ổn định độ đục và cải thiện độ trong.[16]
+ Rút ngắn thời gian lọc.
- Ứng dụng thương mại của chế phẩm pectinase lần đầu tiên là vào năm 1930 trong sản xuất rượu vang và nước trái cây. Chỉ đến năm 1960, bản chất hĩa học và cấu trúc của mơ thực vật được làm sáng tỏ thì enzym pectinase mới được ứng dụng rộng rãi. Năm 2005, thị trường cơng nghệ enzym thế giới là 1.7 - 2 nghìn tỉ đơ.[17]
- Các chế phẩm enzym phá hủy thành tế bào thực vật như pectinase, hemicellulase, cellulase được các nước Châu Âu sản xuất và bán ra thị trường trên thế giới với số lượng nhiều nhất, sản phẩm ứng dụng trong cơng nghệ thực phẩm chủ yếu ở các nước Châu Mỹ và Châu Âu.[17]
- Ở Việt Nam cơng nghệ enzym chưa phát triển. Nghiên cứu vẫn cịn đơn lẻ ở các phịng thí nghiệm để thu nhận enzym từ các vi sinh vật nhưng chưa sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp. Chúng ta đang sử dụng chủ yếu là các enzym thương mại của hãng Novo của Đan Mạch.
2.5.2.1 Nghiên cứu sử dụng enzym pectinase cố định để xử lí puree carrot:
- Nilay Demir, Jale Acar, Kemal Sarioglu, Mehmet Mutlu (2000) đã nghiên cứu sử dụng pectinase cố định để xử lý pure carrot nhằm làm gia tăng hiệu suất nước carrot, lượng carotenoid và tổng hàm lượng chất khơ của sản phẩm.[61]
- Trong nghiên cứu nầy, enzym pectinase Pectinex Ultra SP_L của cơng ty Novo (Đan Mạch) được cố định lên các hạt resin hình cầu cĩ kích thước 525 μm dựa trên nguyên tắc hấp phụ của lực tĩnh điện. Các hạt resin được rửa với nước và dung dịch đệm citrate 0.05M ở pH=4.5. Quá trình cố định enzym được tiến hành ở 40C, pH = 4.5. Các hạt resin được cho vào dung dịch Pectinex Ultra SP_L và khuấy đảo ở nhiệt độ 40C trong thời gian 24 giờ để enzym hấp phụ lên các hạt resin. [61]
- Kết quả nghiên cứu cho thấy enzym cố định làm giảm độ nhớt của puree carrot từ 90 poise xuống 6.5 poise sau 60 phút phản ứng. Lượng enzym cố định cần sử dụng là 6%. Hoạt độ enzym giảm 20% sau 9 mẻ phản ứng. Sau mỗi chu kỳ phản ứng thì pH sản phẩm giảm, nồng độ chất khơ tăng từ 9.2% lên 10.8%. Hiệu suất thu nhận chất chiết tăng 17.7%.[61]
2.5.2.2 Sử dụng chế phẩm cellulase và pectinase để làm tăng hiệu suất trích li carotenoid từ carrot: trích li carotenoid từ carrot:
- Tổng sản lượng carotenoid trên thế giới hàng năm là 100 triệu tấn. Inci Cinar (2004) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm cellulase và pectinase để thủy phân các liên kết trong mơ thực vật nhằm gia tăng hiệu suất trích li sắc tố carotenoid từ carrot và một số thực vật khác.[55]
+ Khi gia tăng hàm lượng chế phẩm pectinase và cellulase thì tốc độ thủy phân nhanh, hiệu suất trích li cao nhưng lại tốn nhiều enzym.[55]
+ Khi sử dụng kết hợp pectinase và cellulase theo 3 nghiệm thức A, B, C ở bảng 2.4, tác giả kết luận: thời gian ảnh hưởng đến hiệu suất trích li nhiều hơn là lượng enzym sử dụng.[55]
Bảng 2.4: Kết hợp hàm lượng chế phẩm pectinase và cellulase Nghiệm thức Pectinase (ml/100g) Cellulase (g/100g) A 10.0 0.5 B 15.0 5.0 C 20.0 10.0
Hình 2.15: Hiệu quả xử lí pectinase và cellulase đến hiệu suất trích li sắc tố carrot [55]
- Trong 3 nghiệm thức khảo sát thì khi gia tăng thời gian xử lý enzym sẽ tăng hiệu suất trích li carotenoid ngoại trừ nghiệm thức C. Đối với nghiệm thức C, hiệu suất trích li cao nhất là sau 6 giờ, sau đĩ nếu cĩ gia tăng thời gian lên nữa thì hiệu suất vẫn giảm đều. Hiệu suất trích li sắc tố ở nghiệm thức C thấp nhất sau 24 giờ xử lý.[55]
- Nghiệm thức A, với thời gian xử lí 18 giờ thu được hiệu suất trích li tương đương với nghiệm thức C với thời gian xử lý là 6 giờ. Nhưng nghiệm thức A sau 24 giờ xử lí lại cho hiệu suất trích li cao nhất. Do đo,ù khi kéo dài thời gian xử lý ở nghiệm thức A cĩ thể giảm lượng chế phẩm enzym cần dùng nhưng chi phí nhiệt năng lại cao.[55]
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Vật liệu: 3.1.1 Carrot:
- Carrot (Daucus carota) được mua từ vựa nơng sản Bình Điền, chúng được trồng tại các nhà vườn ở Đà Lạt.
3.1.2 Chế phẩm enzym:
3.1.2.1 Pectinase: Pectinex Ultra SP_L
- Pectinex Ultra SP_L là tên thương mại của enzym pectinase cĩ xuất xứ từ hãng Novo Đan Mạch do cơng ty Nam Giang cung cấp.
- Pectinex Ultra SP_L được sản xuất từ lồi Aspergillus aculeatus. Chế phẩm bao gồm các loại enzym pectinlyase, pectinesterase và polygalacturonase. Enzym cĩ hoạt độ tối ưu ở nhiệt độ 35- 450C, pH trong khoảng 3.5 - 4.5, hoạt tính của chế phẩm là 26.000PG/ml.
- Pectinex Ultra SP_L là chất lỏng màu nâu cĩ mùi nhẹ của sản phẩm lên men. Khi bảo quản ở 200C, hoạt độ enzym vẫn ổn định trong 3 tháng. Nếu bảo quản lâu hơn thì hoạt tính enzym giảm 1 -2% mỗi tháng.
3.1.2.2 Hemicellulase: Viscozym L
- Chế phẩm Viscozym L là tên thương mại của enzym hemicellulase cĩ