- PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:
3.2 Phương pháp phân tích
3.2.7 Xác định protein theo phương pháp Bradford
Nguyên tắc:
Các protein khi phản ứng với xanh Comasie (Comassie Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất màu cĩ khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sĩng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.[13]
Hố chất:
- Dung dịch protein cần xác định
- Dung dịch albumin 1mg/ml: cân chính xác 10mg albumin pha trong 10 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200C, khi dùng pha lỗng 100 lần, được dung dịch albumin cĩ nồng độ 0.1mg/ml
- Dung dịch thuốc thử Bradford: Comassie Brilliant Blue: 0.001g Ethanol 990: 4.7g Acid phosphoric 85%: 8.5g
Phẩm màu Comassie Briliant Blue làm tan trong ethanol trong chai đựng cĩ nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 1000ml bằng nước cất.[4]
Thực hiện:
Chuẩn bị mẫu phân tích. Dựng đường chuẩn:
m 100 . (m1 – m2)
Để dung dịch albumin chuẩn cĩ các nồng độ từ 10 – 100 μg/ml ta thực hiện như sau:
Bảng 3.2:Dựng đường chuẩn định lượng protein
Dung dịch albumin (ml) 0 1 2 4 6 8 10
Nước cất (ml) 10 9 8 6 4 2 0
Nồng độ protein (μg/ml) 0 10 20 40 60 80 100
Hút 1 ml dung dịch albumin từ mỗi ống nghiệm trên và cho vào ống nghiệm mới, thêm 5ml thuốc nhuộm Bradford. Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống cịn lại 2, 3, 4, 5, 6, mỗi ống cách nhau một phút, lắc đều. Sau 10 phút, đo OD ở bước sĩng 595nm. Dựng đường chuẩn.
Mẫu thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên. Mẫu được pha lỗng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm trừ đi trị số mật độ quang của ống thử 0μg/ml, chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein cĩ trong dung dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml)[4]