- PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:
3.1.2.1 Pectinase: PectinexUltra SP_L
- Pectinex Ultra SP_L là tên thương mại của enzym pectinase cĩ xuất xứ từ hãng Novo Đan Mạch do cơng ty Nam Giang cung cấp.
- Pectinex Ultra SP_L được sản xuất từ lồi Aspergillus aculeatus. Chế phẩm bao gồm các loại enzym pectinlyase, pectinesterase và polygalacturonase. Enzym cĩ hoạt độ tối ưu ở nhiệt độ 35- 450C, pH trong khoảng 3.5 - 4.5, hoạt tính của chế phẩm là 26.000PG/ml.
- Pectinex Ultra SP_L là chất lỏng màu nâu cĩ mùi nhẹ của sản phẩm lên men. Khi bảo quản ở 200C, hoạt độ enzym vẫn ổn định trong 3 tháng. Nếu bảo quản lâu hơn thì hoạt tính enzym giảm 1 -2% mỗi tháng.
3.1.2.2 Hemicellulase: Viscozym L
- Chế phẩm Viscozym L là tên thương mại của enzym hemicellulase cĩ xuất xứ từ hãng Novo Đan Mạch do cơng ty Nam Giang cung cấp.
- Viscozym L được sản xuất từ lồi Aspergillus aculeatus. Sản phẩm gồm nhiều enzym khác nhau như: β-glucanase, arabanase, xylanase, cellulase và hemicellulase.
- Enzym cĩ pH tối ưu trong khoảng 4.5 - 5.5, nhiệt độ 40 - 500C, hoạt tính của chế phẩm 700UI/ml. Nhiệt độ bảo quản ở 0 - 100C
3.1.2.3 Cellulase: Cellulast 1.5 L
- Cellulast 1.5L là tên thương mại của enzym cellulase cĩ xuất xứ từ hãng Novo Đan Mạch. Cellulast 1.5L được sản xuất từ lồi Trichoderma reesi . Enzym nầy hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40 - 500C và pH nằm trong khoảng 4.5 - 5.5. Hoạt tính của chế phẩm là 700UI/ml.
3.2 Phương pháp phân tích:
3.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm (phương pháp sấy khơ): Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Dùng sức nĩng làm bay hết hơi nước trong nguyên liệu (mẫu), cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy. Trọng lượng mẫu mất đi khi sấy khơ tuyệt đối là lượng nước cĩ trong mẫu. Từ đĩ tính ra phần trăm lượng nước cĩ trong mẫu.[13]
Tiến hành:
Cân khoảng 2-5g mẫu gĩi vào giấy nhơm đã sấy khơ. Cân lượng mẫu và giấy trước khi sấy (m1). Sấy cho đến trọng lượng khơng đổi, làm nguội trong bình hút ẩm và cân (m2).[20]
Tính kết quả:
Độ ẩm của mẫu (X) tính theo cơng thức:
M: khối lượng mẫu trước khi phân tích (g)
m1: khối lượng mẫu và giấy nhơm trước khi sấy (g)
m2: khối lượng mẫu và giấy nhơm sau khi sấy đến trọng lượng khơng đổi (g) X: độ ẩm của mẫu (%)[20]
3.2.2 Phương pháp xác định đường tổng: phương pháp Phenol
Nguyên tắc: thực hiện phản ứng tạo màu giữa đường tổng trong mẫu nghiên cứu với thuốc thử phenol khi cĩ sự hiện diện của H2SO4. Cường độ màu được đo bằng máy quang phổ so màu ở bước sĩng 490nm. Dựa vào đồ thị chuẩn
của saccharose tinh khiết với thuốc thử, tính ra hàm lượng đường tổng của mẫu nghiên cứu.[16]
Thực hiện:
Chiết đường từ mẫu thí nghiệm: Nghiền nguyên liệu càn định lượng sau
đĩ cân 1g mẫu phân tích cho vào becher 100ml. Thêm vào 20ml cồn 960, đặt lên nồi cách thủy, đun sơi 3 lần, mỗi lần sơi lấy ra để nguội rồi để lại trên bếp. Khuấy đều, để nguội, lọc qua giấy lọc (khơng cho cặn đổ lên giấy lọc). Sau đĩ thêm 10 ml cồn 800 vào becher đựng mẫu, khuấy đều, đun 2 lần tới sơi trên nồi cách thủy, để nguội, lọc, tiếp tục làm như vậy khoảng 2-3 lần. Sau đĩ đưa cặn lên giấy lọc, tráng cốc 2-3 lần bằng cồn 800 nĩng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi cồn ở nhiệt độ phịng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy. Cặn khơ được hồ tan vào nước đến 50ml. Khi làm hiện màu cĩ thể pha lỗng nếu nồng độ đường quá cao.[13]
Xây dựng đường chuẩn
Lấy 7 bình định mức 100ml, cho vào đĩ theo thứ tự: 1,2,3,4,5,6 và 7ml dung dịch saccharose 0,1%, cho nước cất tới vạch mức. Từ mỗi bình hút ra 1ml, cho thêm 1ml dung dịch phenol 5%. Cẩn thận cho thêm 5ml H2SO4 đậm đặc. Để 10 phút rồi lắc đều, giữ tiếp 10-15 phút ở nhiệt độ phịng để xuất hiện màu. Trong mỗi ống nghiệm sẽ cĩ tương ứng 10, 20, 30, 40, 50, 60 và 70μg saccharose. Đem đo mật độ quang ở bước sĩng λ= 490 nm, vẽ đồ thị chuẩn.
Xác định đường trong mẫu: hút 1ml dung dịch đường cần xác định, tiến hành tương tự như bước xây dựng đường chuẩn saccharose.[13]
Tính kết quả:
Hàm lượng đường tổng số chứa trong 100g mẫu được tính theo cơng thức:
Trong đĩ: x: Hàm lượng đường tương ứng trên đường chuẩn (μg/ml). k: Hệ số pha lỗng.
x.10-6.k.V.100 v.m ĐT =
V: Thể tích dịch đường ban đầu (ml). v: Thể tích mẫu đem phân tích (ml). m: Trọng lượng mẫu (g).[13]
3.2.3 Định lượng đường khử theo phương pháp Miller:
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,5- dinitrosalisylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.[23]
Hố chất:
- Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS): cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml.
- Dung dịch glucose mẫu (500γ/ml): cân 0.5g D-glucose pha trong nước cất thành 1 lít.
Thực hiện:
- Dựng đồ thị chuẩn glucose: Từ dung dịch glucose chuẩn, pha các dung
dịch glucose chuẩn cĩ nồng độ từ 50-250 (γ/ml). Bảng 3.1:Dựng đồ thị chuẩn glucose Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 dd glucose (0.5 mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nước cất (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 dd DNS (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
- Lắc đều và đem đun cách thủy ở 1000C trong 3 phút, làm nguội và thêm 5 ml nước cất. Đo độ hấp thụ ở bước sĩng 530nm trên máy quang phổ. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hồnh là nồng độ glucose.
- Tiến hành thí nghiệm: phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn. Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng.[40]
3.2.4 Phương pháp xác định pectin:
Nguyên tắc: - Trong mơi trường kiềm lỗng, pectin hồ tan sẽ giải phĩng ra nhĩm methoxyl thành rượu methylic và acid pectic tự do. Acid pectic tự do trong mơi trường khi cĩ mặt acid acetic sẽ kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa canxi pectat. Từ hàm lượng muối kết tủa cĩ thể tính được hàm lượng pectin cĩ trong mẫu phân tích.[16]
Hố chất:
- Dung dịch CaCl2 2N: hịa tan 230-250g CaCl2 trong 1000ml nước cất - NaOH 0.1N
- CH3COOH 1N - AgNO3 [13]
Tiến hành:
Xác định hàm lượng pectin trong mẫu nguyên liệu
Cân 5g nguyên liệu, thêm 100ml nước cất, đun cách thủy ở 900C trong 3 giờ, thêm H2O đủ thể tích bằng 100ml. Lấy 20ml dung dịch này cho vào erlen rồi thêm 100ml NaOH 0,1M để yên 7 giờ (cĩ thể qua đêm). Sau đĩ thêm 50ml dung dịch CH3COOH 1M, sau 5 phút thêm 50ml dung dịch CaCl2 2M để yên 1 giờ. Đem đun sơi 5 phút và lọc qua giấy lọc đã được sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi, rửa kết tủa Ca-pectat bằng nước cất nĩng cho đến khi nước rửa khơng cịn ion Cl- (dùng dung dịch AgNO3 1% để thử Cl-). Sau khi sạch kết tủa, cho giấy lọc kết tủa vào chén cân và sấy khơ ở 1050C cho đến trọng lượng khơng đổi. Sự khác nhau về trọng lượng giấy lọc chưa cĩ và cĩ kết tủa cho ta biết được trọng lượng của Ca_pectat.
Vì hàm lượng canxi trong Ca-pectat là 8% nên khi tính hàm lượng pectin ta phải nhân trọng lượng Ca-pectat với 0,92.[13]
Tính kết quả:
Hàm lượng pectin (P) tính theo cơng thức:
P= [(B x 0,92 x 100)/m] x (V/v).
Trong đĩ: B: Trọng lượng Ca-pectat (g).
V: Tổng thể tích dung dịch chiết được (100ml). v: Thể tích dung dịch đem xác định (20ml). m: Trọng lượng mẫu (g).[18]
3.2.5 Phương pháp xác định cellulose: Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính bền của chất này, khơng bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, cịn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hố, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitric với acid acetic.[13]
Hố chất:
- Acid nitric - Acid acetic
- Rượu etylic 96%[23]
Thực hiện:
Cân m (g) mẫu đã nghiền nhỏ (đã sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi ở 100-105oC) cho vào bình nĩn dung tích 250 ml. Thêm vào bình 16,5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đặc và 15 ml acid acetic. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sơi hỗn hợp 30 phút. Để nguội, pha lỗng hỗn hợp bằng nước nĩng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng. Rửa kết tủa cellulose nhiều lần bằng nước cất nĩng (mỗi lần 10-15 ml). Rửa bằng rượu etylic 96% 1-2 lần. Rửa bằng
ete etylic. Sấy giấy lọc cĩ chứa cellulose ở nhiệt độ 100-105oC đến trọng lượng khơng đổi (khoảng 2-3 giờ).[13]
Tính kết quả:
Hàm lượng cellulose được tính bằng cơng thức sau:
Trong đĩ: X: Hàm lượng cellulose tính bằng %. a: Trọng lượng cellulose (g).
m: Trọng lượng mẫu thí nghiệm (g). 100: Hệ số chuyển thành %.[29]
3.2.6 Phương pháp xác định lipid: Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Dùng ete nĩng để hồ tan tất cả chất béo tự do trong thực phẩm. Sau đĩ để bay hơi hết ete, cân chất béo cịn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100g mẫu.[4]
Hố chất:
- Ete dầu hỏa. - Na2SO4 khan.[13]
Thực hiện:
Cân m(g) nguyên liệu, đã được sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi. Cho tất cả nguyên liệu vào ống hình trụ bình cầu của máy. Cho diethyl eter vào khoảng ¾ bình.
Lắp cột làm lạnh, cho nước chảy qua cột, đặt máy lên bếp cách thủy. Đun cách thủy để ly trích lipid đến khi eter trong ống hình trụ khơng màu. Lấy nguyên liệu ra và đem sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi.[13]
a.100 m X =
Tính kết quả:
Phần trăm lipid trong 100g nguyên liệu:
%lipid =
Trong đĩ:
m: khối lượng nguyên liệu m1: Khối lượng trước khi li trích m2: khối lượng sau khi li trích.[13]
3.2.7 Xác định protein theo phương pháp Bradford: Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Các protein khi phản ứng với xanh Comasie (Comassie Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất màu cĩ khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sĩng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.[13]
Hố chất:
- Dung dịch protein cần xác định
- Dung dịch albumin 1mg/ml: cân chính xác 10mg albumin pha trong 10 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200C, khi dùng pha lỗng 100 lần, được dung dịch albumin cĩ nồng độ 0.1mg/ml
- Dung dịch thuốc thử Bradford: Comassie Brilliant Blue: 0.001g Ethanol 990: 4.7g Acid phosphoric 85%: 8.5g
Phẩm màu Comassie Briliant Blue làm tan trong ethanol trong chai đựng cĩ nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 1000ml bằng nước cất.[4]
Thực hiện:
Chuẩn bị mẫu phân tích. Dựng đường chuẩn:
m 100 . (m1 – m2)
Để dung dịch albumin chuẩn cĩ các nồng độ từ 10 – 100 μg/ml ta thực hiện như sau:
Bảng 3.2:Dựng đường chuẩn định lượng protein
Dung dịch albumin (ml) 0 1 2 4 6 8 10
Nước cất (ml) 10 9 8 6 4 2 0
Nồng độ protein (μg/ml) 0 10 20 40 60 80 100
Hút 1 ml dung dịch albumin từ mỗi ống nghiệm trên và cho vào ống nghiệm mới, thêm 5ml thuốc nhuộm Bradford. Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống cịn lại 2, 3, 4, 5, 6, mỗi ống cách nhau một phút, lắc đều. Sau 10 phút, đo OD ở bước sĩng 595nm. Dựng đường chuẩn.
Mẫu thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên. Mẫu được pha lỗng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm trừ đi trị số mật độ quang của ống thử 0μg/ml, chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein cĩ trong dung dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml)[4]
3.2.8 Phương pháp xác định độ tro: Nguyên tắc: Nguyên tắc:
- Dùng sức nĩng (5500C-600oC) nung cháy hồn tồn các chất hữu cơ. Chất vơ cơ cịn lại chính là phần tro. Đem cân và tính ra % tro cĩ trong nguyên liệu.[13]
Tiến hành:
Cân chính xác khoảng 2-5g mẫu phân tích trong một chén sứ đã biết trọng lượng khơ tuyệt đối, cho thêm 5 giọt HNO3 đậm đặc và 1-2 giọt H2O2 30%. Cho vào lị nung ở 500-5500C cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc lá. Lặp lại như trên cho đến khi trọng lượng khơng đổi.[13]
Tính kết quả:
Tổng lượng tro (%) = (G2 – G0 )x100/(G1 – G0)
Trong đĩ: G0 : Trọng lượng của chén nung (g)
G1 : Trọng lượng của chén nung và mẫu thử (g)
G2 : Trọng lượng của chén và tro trắng sau khi nung (g).[13]
3.2.9 Phương pháp xác định vitamin C: bằng phương pháp chuẩn độ iod: Nguyên tắc:
- Iod bị khử bởi vitamin C. Dựa vào lượng Iod bị khử bởi vitamin C cĩ trong mẫu, suy ra hàm lượng vitamin C.[20]
Hố chất:
- Dung dịch HCl 5% - Dung dịch Iod 0.01N - Dung dịch tinh bột 1%[20]
Thực hiện:
- Cân 5 g mẫu, nghiền trong cối sứ với 5ml HCl 5% cho đến khi thành dạng đồng thể rồi chuyển vào bình định mức, cho nước đến vạch 50ml, khuấy đều, lọc. Cho 20ml dịch lọc vào erlen, cho thêm vài giọt hồ tinh bột 1%. Chuẩn độ đến khi bắt đầu xuất hiện màu xanh thì dừng lại.[20]
Tính kết quả:
Hàm lượng vitamin C trong 100g nguyên liệu:
X% =
Trong đĩ:
V: số ml dung dịch iod 0.01N dùng để chuẩn độ V1: thể tích tổng số dịch mẫu (50ml)
V2: thể tích mẫu lấy để xác định (20 ml)
m: số gram nguyên liệu dùng để chiết vitamin C (5g)
V .V1 . 0,00088 . 100 V2 . m
0,00088: số gram vitamin C tương ứng với 1 ml dung dịch iod 0,01N.[20]
3.2.10 Phương pháp xác định độ chua:
- Độ chua bao gồm các acid cĩ trong thực phẩm, các acid này hoặc cĩ sẵn trong nguyên liệu hoặc được thêm vào hoặc được sinh ra trong quá trình chế biến. Độ acid tồn phần bao gồm tất cả các acid cĩ thể định lượng được bằng dung dịch kiềm chuẩn, chủ yếu là các acid hữu cơ như acid acetic, citric, malic… Khí CO2, SO2 cĩ thể ảnh hưởng đến độ chua thực phẩm nên cần loại bỏ khí CO2, SO2 trong nước pha mẫu.
Nguyên tắc:
- Độ chua (lượng acid tổng số) cĩ trong thực phẩm cĩ thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn NaOH để đưa pH tới 8.2, dùng chất chỉ thị màu là phenolphtalein 1%.[20]
Hố chất:
+ Dung dịch NaOH 0.1N
+ Dung dịch phenolphtalein 1% pha trong cồn 900
+ Nước cất đun sơi để loại khí CO2 và SO2[20]
Thực hiện:
- Cân m(g) nguyên liệu xay nhuyễn, lắc với nước trung tính trong 1 giờ. Sau đĩ cho nước trung tính vừa đủ 100ml. Để lắng, lấy 25ml nước trong để chuẩn độ bằng NaOH 0.1N với 5 giọt chỉ thị phenolphtalein cho dến khi dịch thử cĩ màu hồng nhạt bền vững.[20]
Tính kết quả:
Độ acid tồn phần theo phần trăm (X1) tính theo cơng thức:
X1 = V x (V1/v) x (100/m) x N
Trong đĩ: V: Thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ (ml) N: Nồng độ NaOH (1/10N)
V1:Tổng thể tích mẫu ban đầu (100 ml). v: Thể tích mẫu đem phân tích (25 ml).[20]
3.2.11 Phương pháp xác định pH:
- Thực hiện: Cân 5g nguyên liệu hồ tan trong 50ml nước, dùng que thuỷ tinh khuấy đều. Để lắng sau 1 giờ, lấy dịch trong đo với máy đo pH.[23]
3.2.12. Xác định nồng độ chất khơ trong dung dịch bằng khúc xạ kế:
- Khúc xạ kế là dụng cụ dùng để xác định hàm lượng chất khơ cĩ trong mẫu thí nghiệm. Dụng cụ nầy hoạt động dựa trên nguyên tắc là độ lệch giữa tia khúc xạ và tia tới khi chiếu qua mẫu (dạng lỏng) sẽ phụ thuộc vào nồng độ chất khơ của mẫu. Đơn vị đo được tính theo độ Brix (0Br).[23]
3.2.13. Phương pháp đánh giá cảm quan:
- Phân tích cảm quan thực phẩm là phương pháp sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu, mơ tả và định lượng một số tính chất của thực phẩm như màu sắc, hình thái và cấu trúc, mùi, vị.[29]
- Phương pháp phân tích cảm quan được xác định trên cơ sở các cơ quan