Nhiệt độ cảm ứng là yếu tố tác động đáng kể đến sự tăng trưởng của vi sinh vật nói chung và E. coli nói riêng. Sự tăng trưởng của chủng E. coli BL21(DE3)/pVFT-
fljB-hab ứng với các nhiệt độ cảm ứng khác nhau được đánh giá thông qua giá trị OD600 được trình bày trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ OD600
20oC 1,513 ± 0,168
25oC 1,569 ± 0,104
30oC 1,802 ± 0,126
37oC 1,945 ± 0,107
Ở nhiệt độ thấp (20oC), chủng tăng trưởng chậm nên mật độ tế bào thấp không thích hợp cho việc thu nhận lượng lớn protein tái tổ hợp. Kết quả đo OD600 cho thấy khi tăng nhiệt độ cảm ứng, tốc độ tăng trưởng của chủng tăng lên. Điều này cũng phù hợp với đặc điểm tăng trưởng của chủng E. coli nói chung và của chủng E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab nói riêng.
Kết quả điện di SDS-PAGE và xác định phần trăm protein tái tổ hợp trong các mẫu ứng với nhiệt độ cảm ứng khác nhau bằng phần mềm Quantity One được trình bày trong Bảng 3.5 và Hình 3.11.
Bảng 3.5. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2- HAeB theo các nhiệt độ cảm ứng khác nhau.
Nhiệt độ cảm ứng Tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB (%)
20oC 8,7
25oC 8,6
30oC 10,2
37oC 14,9
Kết quả cho thấy lượng protein mục tiêu tăng khi nhiệt độ đạt 37oC, điều này là do khi nhiệt độ tăng thì tốc độ sinh tổng hợp protein của chủng cũng tăng lên. Do vậy, chúng tôi kết luận nhiệt độ cảm ứng tối ưu cho sự biểu hiện protein GST-H:1,2-HAeB là 37oC.
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 64
Hình 3.11. Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau
1, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, cảm ứng ở 20oC; 2, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, cảm ứng ở 25oC; 3, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-
hab, cảm ứng ở 30oC; 4, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, cảm ứng ở 37oC
3.3.3.Ảnh hưởng của ôxi hòa tan lên sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp
Chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của ôxi hòa tan lên sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp thông qua tốc độ lắc (số vòng/phút) của máy lắc ổn nhiệt. Do đó, khi khảo sát tốc độ lắc khi cảm ứng, chúng tôi cũng đánh giá đồng thời hai chỉ tiêu: sự tăng trưởng của chủng và sự biểu hiện của protein mục tiêu. Sự tăng trưởng của chủng được xem xét dựa trên giá trị OD600 tại thời điểm sau cảm ứng. Kết quả được trình bày trong
Bảng 3.6.
Kết quả cho thấy mật độ tế bào cao nhất khi lắc ở tốc độ 250 vòng/phút và thấp nhất là ở tốc độ 150 vòng/phút. Điều này phù hợp vì khi tốc độ lắc càng lớn thì lượng ôxi hòa tan trong môi trường càng tăng, tốc độ tăng trưởng của chủng càng nhanh, mật độ tế bào càng nhiều. Tuy nhiên, sự chênh lệch này không quá lớn, do chủng đã tăng trưởng nhanh ở giai đoạn tăng sinh trước đó và đạt mật độ tế bào nhất định. Vì vậy, tốc độ lắc không ảnh hưởng nhiều đến giá trị OD600 của chủng sau cảm ứng.
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 65
Bảng 3.6. Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau
Tốc độ lắc OD600
150 vòng/ phút 1,429 ± 0,065
200 vòng/ phút 1,538 ± 0,097
250 vòng/ phút 1,674 ± 0,071
Tuy nhiên, để đánh giá sự biểu hiện của protein mục tiêu với các tốc độ lắc khác nhau, chúng tôi tiến hành điện di SDS-PAGE và xác định tỉ lệ protein mục tiêu bằng phần mềm Quantity One. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.7 và Hình 3.11.
Bảng 3.7. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2- HAeB theo các tốc độ lắc khác nhau
Tốc độ lắc cảm ứng Tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB (%)
150 vòng/ phút 7,2
200 vòng/ phút 8,6
250 vòng/ phút 11,3
Hình 3.12. Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau
1, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, tốc độ lắc cảm ứng 150 vòng/phút; 2, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, tốc độ lắc cảm ứng 200 vòng/phút; 3, E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, tốc độ lắc cảm ứng 250 vòng/phút
Kết quả cho thấy khi lắc với tốc độ 250 vòng/phút cho tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB là cao nhất. Ở tốc độ nhanh, lượng ôxi hòa tan nhiều, chủng tăng trưởng nhanh, do đó lượng epitope tái tổ hợp được tạo thành nhiều.Như vậy, dựa vào kết quả khảo sát trên,
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 66
chúng tôi kết luận tốc độ lắc tối ưu cho sự cảm ứng biểu hiện GST-H:1,2-HAeB của chủng chủ E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab là 250 vòng/phút.
3.3.4. Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB trong E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab ở các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu hóa
Sau khi khảo sát các điều kiện biểu hiện, chúng tôi tiến hành cảm ứng biểu hiện protein GST-H:1,2-HAeB trong E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab với các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu hóa. Chúng tôi tiến hành cảm ứng chủng E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab với nồng độ IPTG là 0,5mM, nhiệt độ cảm ứng là 37oC và tốc độ lắc khi cảm ứng là 250 vòng/phút.
Thông qua việc so sánh kết quả điện di SDS-PAGE, lai Western Blot và kết quả định lượng Quantity One, chúng tôi thử đánh giá hiệu quả của sự kết hợp các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu hóa. Kết quả điện di SDS-PAGE, lai Western Blot với kháng thể anti-GST và định lượng bằng phần mềm Quantity One được trình bày trong
Hình 3.13.
Hình 3.13. Kết quả điện di SDS-PAGE (a), lai Western Blot (b) với kháng thể anti- GST và định lượng Quantity One (c) của chủng E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab
được nuôi cấy lắc đã kết hợp các điều kiện tối ưu
1, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, IPTG(-); 2, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, IPTG(+); 3, E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, IPTG(+), mẫu tủa; 4, E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab, IPTG(+), mẫu tan; 5,Thang LWM
3.4. THU NHẬN VÀ TINH CHẾ EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2:HAeB
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 67
3.4.1. Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2:HAeB
Dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab được biểu hiện trong 200ml môi trường LB và tinh chế qua cột GSTrap FF 5ml. Sau đó các mẫu thu ở mỗi bước thực hiện được chạy điện di SDS-PAGE và lai Western Blot với kháng thể anti-GST để kiểm tra. Kết quả điện di được trình bày trong Hình 3.14.
Hình 3.14. Phân tích kết quả tinh chế bằng SDS-PAGE(a) và lai Western Blot(b) 1, Protein tổng trước khi qua cột; 2, Phân đoạn sau khi qua cột; 3, Phân đoạn rửa
cột; 4, Phân đoạn thu nhận protein lần 1; 5,Phân đoạn thu nhận protein lần 2; 6, Thang LWM
Qua kết quả trên cho thấy chúng tôi đã thu nhận được epitope tái tổ hợp GST- H:1,2-HAeB đã được tinh sạch. Tuy nhiên, để tiến hành gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, chúng tôi cần xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp trước khi tiêm chuột.
3.4.2. Xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp sau khi tinh chế
Sau khi tinh chế, mẫu epitope tái tổ hợp được tiến hành xác định độ tinh sạch bằng phần mềm Quantity One. Đồng thời chúng tôi cũng tiến hành đo Nanodrop® mẫu protein thu được. Kết quả được trình bày trong Hình 3.15 và Bảng 3.8.
Kết quả cho thấy, protein thu được chiếm 74,2% lượng protein cuối sau tinh chế. Và lượng protein thu được có nồng độ cao, không bị nhiễm nucleic acid. Như vậy, chúng tôi có thể sử dụng protein sau tinh chế này để tiến hành gây đáp ứng miễn dịch trên chuột.
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 68
Hình 3.15. Kết quả xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp tinh chế bằng SDS-PAGE
1, Protein tổng trước khi qua cột; 2, Phân đoạn sau khi qua cột; 3, Phân đoạn rửa cột; 4,Phân đoạn thu nhận protein lần 1; 5,Phân đoạn thu nhận protein
lần 2
Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng và độ sạch mẫu protein tinh chế bằng đo hấp thu quang phổ
Nồng độ protein 3,95 mg/ml
Tỉ lệ 260/280 0,60
3.5. KIỂM CHỨNG HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU CỦA EPITOPE TÁI TỔ HỢP
3.5.1.Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope HAeB tổng hợp hóa học
Kháng huyết thanh của chuột tiêm epitope HAeB được pha loãng bậc 2 từ 1/50 đến 1/1.600 trong dung dịch pha kháng thể. Protein GST-H:1,2-HAeB được pha loãng và cố định trên giếng với hàm lượng 100ng/giếng. Hàng A được cố định bằng mẫu đối chứng không, chỉ bổ sung dung dịch cố định kháng thể (blank). Kháng huyết thanh chuột trước khi tiêm HAeB ở bậc pha loãng 1/50 được sử dụng làm đối chứng âm (Hàng B). Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của epitope HAeB được xác định bằng mật độ quang ở bước sóng 492nm (OD492) của máy đọc ELISA. Kết quả được công nhận khi OD492 của tín hiệu nền không vượt 0,15. Nếu OD492 lớn hơn 0,15 nhưng nhỏ hơn 3 lần tín hiệu nền thì kết quả không xác định. Khi OD492≥3 lần thì kết quả được xem là dương tính. Kết quả thu được (Hình 3.16) như sau:
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 69
- Tín hiệu nền có giá trị OD492 từ 0,052 – 0,061.
- Mẫu huyết thanh trước khi tiêm epitope (prebleed) ở độ pha loãng 1/50 có giá trị OD492 lớn nhất là 0,069. Như vậy trong huyết thanh chuột ban đầu không hiện diện kháng thể kháng epitope HAeB.
- Mẫu kháng huyết thanh chuột được gây đáp ứng miễn dịch với epitope HAeB đạt giá trị OD492 gấp 3 lần tín hiệu nền là tại kháng huyết thanh có bậc pha loãng 1/50 và 1/100. Như vậy, epitope HAeB có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột tạo kháng thể trong kháng huyết thanh nhận diện được kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB tái tổ hợp.
Hình 3.16. Kết quả ELISA của kháng huyết thanh kháng kháng nguyên epitope HAeB với kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB
3.5.2. Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB
Kháng huyết thanh của chuột được tiêm và nhỏ mũi bằng kháng nguyên GST- H:1,2-HAeB được pha loãng bậc 2 từ 1/50 đến 1/1.600 trong dung dịch pha kháng thể. Epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB được pha loãng và cố định trên giếng với hàm lượng 100ng/giếng. Hàng A được cố định bằng mẫu đối chứng không, chỉ bổ sung dung dịch cố định kháng thể (blank). Kháng huyết thanh chuột trước khi tiêm kháng nguyên tái tổ hợp ở bậc pha loãng 1/50 được sử dụng làm đối chứng âm (Hàng B). Tính kháng nguyên của epitope tái tổ hợp được xác định bằng mật độ quang ở bước sóng 492nm (OD492) của máy đọc ELISA. Ngoài ra, chúng tôi cũng sử dụng kháng huyết thanh của chuột được tiêm kháng nguyên GST-H:1,2 được pha loãng bậc 2 từ
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3OD492 Blank Prebleed 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 kháng huyết thanh
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 70
1/50 đến 1/3200 trong dung dịch pha kháng thể để làm đối chứng khẳng định tính chuyên biệt của kháng thể kháng HAeB.
Kết quả thu được (Hình 3.17 và Hình 3.18) như sau: - Tín hiệu nền có giá trị OD492 từ 0,053 – 0,069
- Mẫu huyết thanh trước khi tiêm và nhỏ mũi protein tái tổ hợp (prebleed) ở độ pha loãng 1/50 có giá trị OD492 lớn nhất là 0,069 và 0,063. Như vậy trong huyết thanh chuột ban đầu không hiện diện kháng thể kháng epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.
- Mẫu kháng huyết thanh chuột được gây đáp ứng miễn dịch bằng cách tiêm với epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB đạt giá trị OD492 gấp 3 lần tín hiệu nền là tại kháng huyết thanh có bậc pha loãng 1/50, 1/100, 1/200 và 1/400.
- Mẫu kháng huyết thanh chuột được gây đáp ứng miễn dịch bằng cách nhỏ mũi với protein dung hợp GST-H:1,2-HAeB đạt giá trị OD492 gấp 3 lần tín hiệu nền là tại kháng huyết thanh có bậc pha loãng 1/50, 1/100 và 1/200. Như vậy, epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB có tính kháng nguyên, gây đáp ứng miễn dịch trên chuột tạo kháng thể nhận diện được kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB tái tổ hợp.
Hình 3.17.Kết quả ELISA của kháng huyết thanh từ chuột được tiêm kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB và kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB
- Giá trị OD492 của kết quả ELISA ở các bậc pha loãng 1/50, 1/100 và 1/200 của mẫu kháng huyết thanh chuột được tiêm epitope tái tổ hợp luôn cao hơn so với mẫu kháng huyết thanh chuột được nhỏ mũi protein tái tổ hợp (Hình 3.19). Đồng thời, trong quá trình thực hiện, chúng tôi còn ghi nhận tại vị trí tiêm epitope xảy ra phản ứng viêm cục bộ kéo dài gần 1 tuần sau khi tiêm.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35OD492 Blank Prebleed 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 kháng huyết thanh
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 71
Hình 3.18.Kết quả ELISA của kháng huyết thanh từ chuột được nhỏ mũi kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB và kháng nguyên GST-H;1,2-HAeB
- Bên cạnh đó, giá trị OD492 trong kết quả ELISA của kháng huyết thanh chuột được tiêm và nhỏ mũi GST-H:1,2-HAeB cũng cao hơn so với chuột được tiêm epitope HAeB. Qua đó cho thấy việc dung hợp epitope với protein lông roi H:1,2 của vi khuẩn
Salmonella Typhimurium cho kết quả đáp ứng miễn dịch tốt hơn.
Hình 3.19. Kết quả ELISA so sánh khả năng nhận diện kháng nguyên GST- H:1,2-HAeB của các kháng huyết thanh khác nhau
- Chúng tôi nhận thấy giá trị OD492 trong kết quả ELISA của kháng huyết thanh chuột được tiêm GST-H:1,2-HAeB cao hơn so với kháng huyết thanh chuột được tiêm GST-H:1,2. Điều này có thể do trong kháng huyết thanh của chuột được tiêm GST- H:1,2-HAeB ngoài kháng thể kháng GST-H:1,2 còn có thể có khả năng hiện diện kháng thể kháng HAeB. Tuy nhiên để chắc chắn hơn, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng nhận diện của kháng thể HAeB trong kháng huyết thanh chuột được tiêm và nhỏ mũi GST-H:1,2-HAeB đối với virus H5N1 bất hoạt.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35OD492 kháng huyết thanh Blank Prebleed 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 72
3.5.3. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng huyết thanh đối với virus H5N1
Kháng huyết thanh của chuột được tiêm epitope HAeB được pha loãng bậc 2 từ 1/50 đến 1/1.600 trong dung dịch pha kháng thể. Virus H5N1 bất hoạt được pha loãng đạt được nồng độ tương đương 16 đơn vị ngưng kết hồng cầu và cố định trên giếng. Hàng A được cố định bằng mẫu đối chứng không, chỉ bổ sung dung dịch cố định kháng thể (blank). Kháng huyết thanh chuột trước khi tiêm kháng nguyên tái tổ hợp ở bậc pha loãng 1/50 được sử dụng làm đối chứng âm. Kết quả thu được (Hình 3.20) như sau:
- Tín hiệu nền có giá trị OD492 từ 0,052 – 0,069.
- Mẫu huyết thanh trước khi tiêm epitope (prebleed) ở độ pha loãng 1/50 có giá trị OD492 lớn nhất là 0,061. Như vậy trong huyết thanh chuột ban đầu không hiện diện kháng thể kháng epitope HAeB.
Hình 3.20. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của kháng huyết thanh chuột tiêm epitope HAeB
- Mẫu kháng huyết thanh chuột được gây đáp ứng miễn dịch bằng cách tiêm với epitope HAeB đạt giá trị OD492 gấp 3 lần tín hiệu nền là tại kháng huyết thanh có bậc pha loãng 1/50. Như vậy, epitope HAeB có khả năng tạo kháng thể đặc hiệu nhận diện được virus H5N1 bất hoạt.
Tương tự chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của kháng huyết thanh kháng GST-