Vector biểu hiện được thiết kế nhằm kiểm soát sự phiên mã các gen được dòng hóa, giúp cho các gen này biểu hiện vào một giai đoạn nhất định trong chu kỳ tăng trưởng của tế bào chủ. Một số vector phổ biến được sử dụng trong tạo dòng và biểu hiện ở tế bào E. coli như plasmid, phage lamda,… Tuy nhiên, plasmid được sử dụng phổ biến vì tính đơn giản, dễ thiết kế, thuận lợi cho việc biến nạp và tái tổ hợp. Đồng thời nhiều vector biểu hiện đã được biến đổi một số đặc điểm di truyền trên vùng vector như vùng kiểm soát sự phiên mã, dịch mã, vùng điều hòa tín hiệu tiết,… nhằm thu nhận lượng lớn protein mục tiêu.
Một vector biểu hiện tốt cần phải có trình tự ori để tạo nhiều bản sao, gen chỉ thị để duy trì vector trong tế bào, một promoter mạnh dễ cảm ứng, và vùng khởi đầu dịch mã tốt (trình tự gắn với ribosome phải nằm ở vị trí cách codon khởi đầu dịch mã một đoạn xác định hoặc cấu trúc bậc hai của mRNA không ngăn chặn sự tương tác với ribosome,…).
Có nhiều hệ thống vector biểu hiện protein dung hợp, trong đó vector pVFT (Hình 1.3) tỏ ra có nhiều ưu điểm trong việc biểu hiện mạnh protein tái tổ hợp trong E. coli vì:
- Sự biểu hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promoter T7.
- Gen lacI mã hóa cho repressor kiểm soát âm hoạt động của promoter T7, lac
repressor chỉ bị bất hoạt khi được cảm ứng bằng lactose hoặc IPTG. Nhờ đó, ta có thể kiểm soát được biểu hiện của đoạn gen được chèn.
- Vị trí gắn ribosome.
- Chứa nhân tố chọn lọc là đoạn gen kháng kanamycin.
- Trình tự gen mã hóa cho 6 histidine ở đầu 3’ của gen mục tiêu, cho phép tạo một đuôi oligonucleotide 6 His ở đầu C của protein mục tiêu, thuận lợi cho việc phát hiện và tinh sạch protein mục tiêu.
- Vùng MCS (multi cloning site) chứa các trình tự duy nhất của các enzyme cắt giới hạn.
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 21 - Trình tự kết thúc dịch mã
- Vùng trình tự mã hóa cho protein GST ngay trước vị trí nhận biết của protease TEV (Tobacco etch virus) giúp tăng khả năng thu nhận và tinh sạch protein ngoại lai. Đồng thời, sau khi thu nhận protein dung hợp, đuôi GST sẽ được loại bỏ dễ dàng nhờ enzyme protease TEV để đảm bảo tính năng mong muốn của protein mục tiêu. Đoạn gen được chèn vào vùng MCS, ngay sau vùng GST, tạo protein dung hợp với GST.
Nco I His-tag
CC ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG thrombin Nde I GST-Tag SpeI-NheI Kpn I
CGC GGC AGC CAT ATG TCC CCT……GGT TCA ACT AGC GGT ACC ACG GAA AAC TEV recognition site BamH I EcoR I Sac I Sal I Hind III Not I
CTG TAT TTT CAG GGA TCC GAA TTC GAG CTC CGT CGA CAA GCT TGC GGC CGC Xho I His-tag Stop
ACT CGA GCA CCA CCA CCA CCA CCA CTG AGA TCC GGC TGC TAA
Hình 1.3. Cấu trúc vùng MCS của hệ thống biểu hiện pVFT 2S