cột để phân tích khả năng gắn lên cột của các protein GST-H:1,2-HAeB. Rửa cột bằng 15ml Binding buffer nhằm loại bỏ những thành phần không bắt chuyên biệt ra khỏi cột.
Tiến hành ly giải thu nhận protein mục tiêu bằng cách cho 15ml Elution buffer đi qua cột. Thu nhận dịch đi qua cột.
Các mẫu sau khi thu nhận được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE và khẳng định kết quả bằng lai Western Blot.
So sánh các vạch protein của mẫu với mẫu đối chứng, xác định vạch protein dung hợp.
c. Xác định độ tinh sạch của protein tái tổ hợp
Mẫu điện di SDS-PAGE được scan để lưu giữ dưới dạng file ảnh. Sau đó ảnh này được sử dụng để phân tích bằng phần mềm Quantity One, tiện ích Band Analysis. Các bước thực hiện như sau:
Mở giao diện Quantity One, tiện ích Band Analysis.
Mở file mục tiêu.
Chọn chức năng Transform, Auto-scale để tối ưu hóa hình ảnh.
Xác định vùng gel cần phân tích bằng chức năng Frame-lane.
Trong vùng phân tích, chọn một giếng và chọn chức năng Lane-Background để xác định background của hình ảnh.
Phát hiện các vạch protein trong các giếng bằng chức năng Detect Band.
Cuối cùng sử dụng chức năng Band Attribute/ Relative Quantity để xác định tỷ lệ từng vạch protein so với tổng protein trong mỗi giếng.
2.2.9. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB GST-H:1,2-HAeB
Trong luận văn này, chúng tôi sử dụng hai phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột đó là tiêm dưới da và nhỏ mũi. Kháng nguyên được sử dụng gồm hai loại là HAeB tổng hợp hóa học và HAeB tái tổ hợp ở dạng dung hợp GST-H:1,2-
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 48
HAeB. Ngoài ra, để làm đối chứng kháng nguyên GST-H:1,2 cũng được dùng làm kháng nguyên để gây đáp ứng miễn dịch trong thí nghiệm.
Phương pháp tiêm dưới da
Kháng nguyên được pha với nồng độ thích hợp và trộn chung với tá chất theo tỉ lệ 1:1 sẽ được tiêm vào dưới niêm mạc bụng chuột. Hai dạng tá chất được sử dụng đó là Complete Freund's Adjuvant (CFA) và Incomplete Freund's Adjubvant (IFA). Trong lần tiêm đầu tiên, kháng nguyên được trộn chung với CFA để tạo được hiệu quả cao nhất. Trong những lần tiêm nhắc sau đó, IFA được sử dụng để kích thích hệ miễn dịch. Kháng thể chủ yếu được tạo ra trong cách gây đáp ứng miễn dịch tiêm dưới da là IgG.
Phương pháp nhỏ mũi
Kháng nguyên được pha với nồng độ thích hợp và nhỏ từng giọt vào mũi chuột nhằm gây đáp ứng miễn dịch với đường hô hấp vì đây cũng là con đường lây nhiễm chính của virus cúm A/H5N1. Kháng nguyên sẽ bị các tế bào trình diện kháng nguyên trong dịch nhầy của đường hô hấp bắt lấy và trình diện cho hệ miễn dịch dịch thể ở phổi. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch này tạo ra kháng thể chủ yếu là IgA.
Bố trí thí nghiệm
Chuột nhắt trắng khỏe mạnh được cung cấp từ Viện Pasteur TP. HCM được nuôi ổn định trong 3 ngày, khối lượng chuột từ 15-20g/con. 15 con chuột được chia thành 5 lô thí nghiệm:
+ Lô 1: số lượng 3 con, sử dụng peptide HAeB để tiêm.
+ Lô 2: số lượng 3 con, sử dụng protein GST-H:1,2-HAeB để tiêm.
+ Lô 3: số lượng 3 con, sử dụng protein GST-H:1,2-HAeB để nhỏ mũi.
+ Lô 4: số lượng 3 con, sử dụng protein GST-H:1,2 để tiêm.
+ Lô 5: số lượng 3 con, sử dụng vaccine thương mại để tiêm.
-Chuột được tiêm 100µl dịch bao gồm: 50µl dung dịch PBS và 50µg kháng nguyên đã được nhũ tương hóa trong 50µl CFA dùng cho mũi tiêm đầu tiên và được thay bằng IFA trong các lần tiêm nhắc.
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 49
-Một tháng sau lần tiêm và nhỏ mũi đầu tiên, thực hiện tiêm và nhỏ mũi nhắc với lượng kháng nguyên giảm một nửa, nhưng thể tích và tỉ lệ adjuvant không đổi.
-Một tuần sau khi tiêm nhắc, tiến hành thu máu tĩnh mạch hốc mắt chuột bằng ống mao quản (2ml/con). Ly tâm 3.000vòng/ph, 30phút, 4oC.
-Thu huyết thanh và trữ lạnh ở -20oC chuẩn bị làm thử nghiệm ELISA.
-Hai tuần sau khi tiêm nhắc, tiến hành tiêm nhắc lần tiếp theo và thu máu. Tổng cộng thực hiện 3 lần tiêm nhắc và 3 lần thu máu.