tổ hợp [7], [21]
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Đây là một phương pháp đơn giản, có độ nhạy cao để phát hiện hay định lượng kháng nguyên và kháng thể thay thế cho các phương pháp miễn dịch khác như: ngưng kết miễn dịch, sử dụng các đồng vị phóng xạ.
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 24 Qui trình ELISA gồm các bước cơ bản sau:
- Cố định kháng nguyên hay kháng thể lên giếng: hầu hết các đĩa ELISA hiện nay làm từ polystyrene hoặc từ dẫn xuất của polystyrene, cho phép tạo ra các tương tác kỵ nước giữa protein với các chuỗi carbon chứa vòng benzene trên bề mặt giếng. Để tăng hiệu quả gắn protein lên bề mặt giếng, bề mặt các đĩa ELISA đã được cải tiến bằng cách tăng lực tương tác kỵ nước như thêm các nhóm carboxyl, hydroxyl, nhóm amine, hydrazine và N-oxysuccinimide.
- Khóa các vị trí không có kháng nguyên hoặc kháng thể: sau khi cố định kháng thể hoặc kháng nguyên lên bề mặt giếng thường còn để lại những vị trí trống có thể tạo sự gắn không đặc hiệu dẫn đến làm tăng tín hiệu nền và giảm độ nhạy, độ đặc hiệu. Các vị trí này được khóa lại bằng một số hợp chất như albumin huyết thanh bò, sữa gầy, casein hoặc caseinate, huyết thanh, gelatin cá, phổ biến nhất là sữa gầy.
- Hình thành phức hợp miễn dịch: kháng nguyên hoặc kháng thể cần phát hiện được bổ sung vào giếng. Nếu kháng nguyên được cố định trên giếng thì kháng thể sơ cấp được bổ sung vào (trường hợp 1). Nếu kháng thể được cố định thì kháng nguyên được bổ sung vào (trường hợp 2). Tiếp theo, kháng thể thứ cấp cộng hợp với enzyme kháng kháng thể sơ cấp được bổ sung (đối với trường hợp 1) hoặc kháng thể cộng hợp enzyme kháng kháng nguyên được bổ sung (đối với trường hợp 2).
- Đo hoạt tính enzyme: cơ chất của enzyme cộng hợp được bổ sung vào giếng và tạo sản phẩm có màu được hình thành. Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu.
ELISA được dùng để phát hiện và định lượng kháng nguyên hay kháng thể phụ thuộc vào kháng nguyên hay kháng thể được cố định trên pha rắn. Mỗi ứng dụng này lại có một số dạng ELISA khác nhau.
- Các dạng ELISA cố định kháng nguyên: ELISA kháng nguyên trực tiếp, ELISA kháng nguyên / kháng thể gián tiếp, ELISA ức chế kháng nguyên, ELISA kháng thể cạnh tranh.
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 25
- Các dạng ELISA cố định kháng thể: ELISA kháng thể trực tiếp, ELISA kháng nguyên cạnh tranh, ELISA sandwich.
Với mục đích phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên và kháng thể hiện diện trong kháng huyết thanh, dạng ELISA kháng nguyên/kháng thể gián tiếp được chọn để sử dụng trong luận văn này. Điều này giúp thu được kết quả có độ nhạy cao hơn so với dạng trực tiếp, đồng thời thao tác cũng đơn giản hơn so với các dạng khác.
PHẦN 2
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 26
2.1.VẬT LIỆU