Thu nhận gen fljB bằng phương pháp PCR và xử lý bằng enzyme EcoR I-

SalI

Gen fljB được thu nhận bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu fljB-F,

fljB-R và plasmid là pGEX-fljB.

Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp

Trang 35 Thành phần phản ứng PCR như sau:

MilliQ 39l

Buffer Pfu polymerase 5l

dNTPs (8mM) 2,5l

Mồi 5’ fljB-F 1l

Mồi 3’ fljB-R 1l

Plasmid pGEX-fljB 1l

Pfu DNA polymerase (1u/l) 0,5l Tổng thể tích phản ứng 50l

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và được tinh sạch bằng bộ kit EZ-10 Spin Column DNA PCR purification (Bio Basic INC). Qui trình thực hiện:

- Hỗn hợp PCR gen được cho vào eppendorf 1,5ml. Sau đó bổ sung Binding buffer với tỉ lệ 3:1 (v/v). Chuyển dung dịch vào cột, để yên 2 phút ở nhiệt độ phòng. Đem ly tâm 10.000 vòng/phút, 2 phút, đổ bỏ dịch sau khi qua cột.

- Bổ sung 500µl Wash solution vào cột. Ly tâm 10.000 vòng/phút, 2 phút. Đổ bỏ phần dịch sau khi qua cột. Thực hiện 2 lần. Sau đó spin 10.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash solution.

- Chuyển cột sang một eppendorf mới. Bổ sung 30 – 50µl elution buffer vào cột, ủ trong 2 phút, ở nhiệt độ 50 - 70oC.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút, 2 phút, thu phần dịch chứa gen.

- Điện di kiểm tra gen sau tinh chế.

Sau khi tinh chế, gen fljB được xử lý với cặp enzyme cắt giới hạn EcoRI –

SalI, tạo sản phẩm đầu dính. Thành phần phản ứng cắt đoạn gen fljB: 95C 94C 62C 72C 5 phút 1 phút 45 giây 2 phút 10 phút 2 x(30 chu kỳ)

Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp Trang 36 Buffer O 1μl Gen fljB 4μl EcoRI 0,5μl SalI 0,5μl Mili Q 4μl Tổng thể tích 10μl

Các thành phần của phản ứng được cho vào eppendorf 1,5ml, ủ ở 37oC trong 4 giờ. Sau đó, lấy mẫu đem điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. Sản phẩm cắt được tinh sạch bằng bộ kit EZ-10 Spin Column DNA PCR purification.