a. Hóa chất tách chiết plasmid
- Dung dịch I: glucose 50mM; Tris - HCl 2,5mM (pH 8,0); EDTA 10mM (pH 8,0)
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 30
- Dung dịch II: 860µl dH2O; 100µl SDS 10%; 40µl NaOH 5N, chỉ pha trước khi sử dụng, dùng cho 5ml sinh khối tế bào
- Dung dịch III: 5M potassium acetate; 0,2M glacial acetic acid; nước cất; pH4,8; giữ trong tủ mát
- Dung dịch TE: Tris - HCl 10mM (pH 8,0); EDTA 1mM (pH 8,0)
- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0) (giữ ở 4oC)
- RNase 10mg/ml (giữ ở -20oC)
- Chloroform (giữ ở 4oC)
- Ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20oC)
- Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)
b. Hóa chất điện di agrose
- Agarose
- Ethidium bromide 10mg/ml
- Dung dịch TAE 50X (pH 7,9–8,0), Tris-acetate 40mM; EDTA 0,1M; pH 8,0
- Dung dịch nạp mẫu (loading dye): bromophenol blue 0,25%; xylene cyanol 0,25%; glycerol (pha trong TAE) 40%
c. Hóa chất dùng để tinh sạch plasmid, DNA
Sử dụng bộ kit EZ-10 Spin Column DNA PCR purification (Bio Basic INC): Binding buffer, Wash solution, Elution.
d. Hóa chất làm tế bào khả nạp
- Dung dịch MgCl2 80mM - CaCl2 20mM vô trùng (giữ ở 4oC)
- Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng (giữ ở 4oC)
- Dung dịch glycerol 80% vô trùng (giữ ở 4oC)
- dH2O vô trùng (giữ ở 4oC)
e. Hóa chất dùng cho phản ứng cắt hạn chế và phản ứng nối
- SalI, EcoRI, buffer O và buffer 10X Tango tương ứng sử dụng cho phản ứng cắt (Fermentas, Đức)
- T4 ligase và buffer 10X tương ứng sử dụng cho phản ứng nối (Fermentas, Đức)
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 31
- Taq DNA polymerase (Fermentas, Đức)
- Pfu DNA polymerase (Fermentas, Đức)
- dNTPs 8mM (Fermentas, Đức)
- Buffer 10X tương ứng (Fermentas, Đức)
- MgCl2 25mM (Fermentas, Đức)
g. Hóa chất điện di protein
- Tris – HCl 1,5M (pH 8,8 và 6,8), 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 4oC), SDS 10%, ammonium persulfate (APS) 10%, TEMED (N, N, N’, N’ tetramethylethylene diamine) (giữ ở 4oC).
- Dung dịch điện di protein 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3) có thành phần: Tris – HCl 15,1g; glycine 94g; SDS 5g; nước cất đủ 1 lít.
- Dung dịch nạp mẫu 5X: Tris - HCl pH 6,8 10ml; dithiothreitol 1,54g; SDS 0,4g; glycerol 4ml; bromophenol blue (dạng vết) pha trong 20ml dung dịch.
- Dung dịch nhuộm gel: coomassive brilliant blue 0,625g; glacial acetic 25ml; ethanol tuyệt đối 112,5ml pha trong 1 lít dung dịch.
- Dung dịch giải nhuộm: ethanol tuyệt đối 100ml; glacial acetic 100 ml pha trong 1 lít dung dịch.
h. Hóa chất lai Western Blot
- Dung dịch Towbin: 3g Tris-HCl; 14,4g glycine; 1g SDS; nước cất đủ 800ml; 200ml methanol (thêm vào trước khi sử dụng)
- Dung dịch PBS (Phosphate buffered saline): Na2HPO4 80mM; NaH2PO4
20mM; NaCl 100mM; pH 7,5
- Dung dịch PBST (Phosphate buffered saline Tween): 500ml dung dịch PBS; 2,5ml Tween20
- Dung dịch khóa màng: 5% sữa gầy trong dung dịch PBST
- Dung dịch chứa kháng thể anti-GST: 15ml dung dịch PBST; 0,5µl kháng thể anti-GST (10mg/ml) (Abcam, Anh)
- Dung dịch chứa kháng thể anti-Ig chuột-HRP: 15ml dung dịch PBST; 0,5µl kháng thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Abcam, Anh)
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 32
- Dung dịch hiện phim 4X
- Fixer 4X
i.Hoá chất dùng cho tinh chế protein dung hợp GST
- Binding buffer (PBS 1X) pH 7,3: 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
- PMSF (phenyl, methyl sulphonyl fluoride)
- Lysozyme
- Dung dịch phá màng tế bào: dung dịch PBS 1X
- Dung dịch cân bằng và rửa cột: dung dịch PBS 1X
- Dung dịch dung ly protein (Elution buffer pH 8,0): 50 mM Tris – HCl, 10 mM glutathione khử
j.Hóa chất tiêm chuột
-Complete Freund’s Adjuvant
-Incomplete Freund’s Adjuvant
-PBS 1X
k.Hóa chất ELISA
-Phosphate buffered saline (PBS) 50X (pH 7,6-8,0): Na2HPO4.2H2O 89g; NaH2PO4 7,8g; dH2O 1000ml
-Dung dịch cố định kháng thể lên giếng (coating buffer pH 9,6): Na2CO3 0,32g; NaHCO3 0,586g; sodium azide 0,04g; dH2O 200ml
-Dung dịch khóa giếng (blocking buffer): 5% sữa gầy trong dung dịch Coating buffer
-Dung dịch rửa (wash buffer): PBS 50X 20ml; NaCl 14,61g; Tween 20 1ml; dH2O 1000ml
-Dung dịch pha kháng thể (serum dilution buffer): PBS 50X 20ml; NaCl 8,77; Tween 20 1ml; dH2O 1000ml
-Kháng thể thứ cấp Anti mouse IgG-HRP
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 33
-Dung dịch pha cơ chất OPD (citrate buffer pH5): citric acid 0,1M; Na2HPO4
0,1M
-OPD buffer pH5: 0,4mg OPD (ortho-phenylenediamine dihydrochloride)/1ml citrate buffer
-OPD-H2O2 buffer: 1µl H2O2/2ml OPD buffer
-Dung dịch ngừng phản ứng: H2SO4 2M
l.Hóa chất khác
-Kháng sinh: kanamycin 50mg/ml (giữ ở -30oC).
-Dung dịch cảm ứng: IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) 1M (giữ ở -30oC).
m. Môi trường
- Môi trường LB (Luria-Bertani): trypton 10g; NaCl 5g; cao nấm men 5g pha trong 1 lít môi trường.
- Môi trường LB agar: thành phần như môi trường LB lỏng có bổ sung 2% agar (giữ ở 4oC)
Tất cả các môi trường trên đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
- Môi trường LB-Kan30 là môi trường LB đã hấp khử trùng có bổ sung thêm kanamycin để đạt nồng độ cuối 30µg/ml ở 40 - 45oC
- Môi trường LB-Kan30 agar là môi trường LB lỏng có bổ sung 2% agar đã được hấp khử trùng, và sau đó bổ sung thêm kanamycin để đạt nồng độ cuối 30µg/ml ở 40 - 45oC.