GST-H;1,2-HAeB bằng phương pháp ELISA gián tiếp
a. Qui trình ELISA gián tiếp
Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu do tế bào B là sự hình thành kháng thể có thể được phát hiện và định lượng bằng phương pháp ELISA. Mức độ hiện diện kháng thể trong phức hợp miễn dịch được đánh giá thông qua giá trị OD492.
Qui trình ELISA gián tiếp được thực hiện như sau:
-Pha loãng kháng nguyên với nồng độ thích hợp và cho vào mỗi giếng 100µl. Mỗi mẫu được thực hiện lặp lại trên 2 giếng. Phủ lên đĩa một tấm plastic.
-Ủ trong 2 giờ tại nhiệt độ phòng hoặc ủ qua đêm ở 4oC.
-Hút bỏ dung dịch kháng nguyên và rửa lại 3 lần với 100µl PBS/giếng, 5 phút/lần.
-Khóa những vị trí có gắn protein trong giếng bằng 100µl/giếng sữa gầy 5%.
-Phủ lên đĩa một tấm plastic.
-Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc ủ qua đêm ở 4oC.
-Rửa lại 5 lần bằng PBS, 5 phút/lần.
-Pha loãng kháng huyết thanh với nồng độ thích hợp trong serum dilution buffer và cho vào mỗi giếng 100µl.
-Phủ tấm plastic lên đĩa và ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 50
-Pha loãng kháng thể thứ cấp tại nồng độ 1/5.000 trong serum dilution buffer và cho vào mỗi giếng 100µl.
-Phủ tấm plastic lên đĩa và ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
-Rửa lại 5 lần bằng PBS, 5 phút/lần.
-Cho 100µl OPD - H2O2 vào mỗi giếng, phủ giấy bạc để tránh ánh sáng.
-Ủ khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
-Dừng phản ứng bằng H2SO4 2M với thể tích 100µl/giếng.
-Đo cường độ màu bằng máy đo OD ở bước sóng 492 nm.
b. Kiểm chứng tính kháng nguyên, khả năng tạo kháng thể và xác định hiệu giá kháng thể của epitope HAeB
-Kháng nguyên dùng để phủ giếng là GST-H:1,2-HAeB được pha loãng với nồng độ 1ng/l, sau đó cố định lên đĩa ELISA mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần, 100µl/giếng. Hàng A cố định mẫu chứng không chỉ bổ sung đệm phủ giếng (coating buffer).
-Kháng thể sơ cấp được dùng là kháng huyết thanh thu nhận từ lô chuột thí nghiệm được tiêm epitope HAeB được pha loãng bậc 2 từ 1/50 đến 1/3200 trong serum dilution buffer. Đồng thời, chứng âm là mẫu huyết thanh được thu nhận trước khi tiêm chuột.
-Kháng thể thứ cấp được dùng là kháng thể thương mại Anti mouse IgG+IgA+IgM-HRP được pha loãng ở nồng độ 1/5.000 trong serum dilution buffer.
-Các bước tiến hành tương tự mục a.
c. Kiểm chứng tính kháng nguyên, khả năng tạo kháng thể và xác định hiệu giá kháng thể của epitope tái tổ hợp GST-H;1,2-HAeB
-Kháng nguyên dùng để phủ giếng là protein GST-H:1,2-HAeB được pha loãng với nồng độ 1ng/l, sau đó cố định lên đĩa ELISA mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần, 100µl/giếng. Hàng A cố định mẫu chứng không chỉ bổ sung đệm phủ giếng (coating buffer).
-Kháng thể sơ cấp được dùng là kháng huyết thanh thu nhận từ các lô chuột thí nghiệm được tiêm và được nhỏ mũi protein GST-H:1,2-HAeB sẽ pha loãng bậc 2
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 51
từ 1/50 đến 1/1.600 trong serum dilution buffer. Đồng thời, chứng âm là mẫu huyết thanh được thu nhận trước khi tiêm chuột.
-Kháng thể thứ cấp được dùng là kháng thể thương mại Anti mouse IgG+IgA+IgM-HRP được pha loãng ở nồng độ 1/5.000 trong serum dilution buffer.
-Các bước tiến hành tương tự mục a.