Phương pháp tinh chế này là một trong những phương pháp tinh chế quan trọng nhất hiện nay dựa trên khả năng gắn của các phân tử sinh học. Các protein mục tiêu được kết hợp với các đuôi dung hợp. Các đuôi này tương tác chuyên biệt với ligand được gắn trên các giá thể trơ, có thể là dạng hạt hay dạng cột. Ligand phải bám tốt vào phân tử mục tiêu nhằm bắt giữ chúng trong các thể liên kết trong hỗn hợp. Việc lựa chọn đuôi dung hợp tùy thuộc vào điều kiện tinh chế protein và cách thức cắt bỏ đuôi dung hợp ở vị trí chuyên biệt. Có khá nhiều loại đuôi dung hợp đã được phát triển như: β- galactosidase, glutathione-S-transferase, polyhistidine, protein A,… thông qua các ligand tương ứng như ρ-amionophenyl-β-thiogalactosidase, globulin miễn dịch IgG, glutathione và amylose. Tuy nhiên, đuôi dung hợp GST và polyhistidine được sử dụng phổ biến nhất.
Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 22
Thông thường các đuôi dung hợp thường được chèn thêm một vị trí cắt chuyên biệt của một protease nhằm giúp loại bỏ đuôi sau khi tinh chế.
Phương pháp tinh chế dựa trên sắc ký ái lực này thường trải qua ba bước chính là gắn kết, rửa và dung ly phân tử protein mục tiêu ra khỏi chất nền.
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp tinh chế dựa vào đuôi dung hợp GST. Đây là một họ enzyme có khả năng biến đổi các hợp chất độc (như nitơ và halogen) bằng cách gắn thêm sulfur từ glutathione. Đa số các loại GST động vật được tinh chế nhờ sắc ký ái lực với cơ chất glutathione, được rửa bằng lượng thừa glutathione dạng khử. Dựa trên tính chất này, Smith và John (1988) đã phát hiện hệ thống biểu hiện dung hợp gen với GST. Sau khi dung hợp vào đầu C của GST, protein tái tổ hợp có thể được tinh chế hiệu quả nhờ phương pháp sắc ký ái lực glutathione.
Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế vì GST là một protein có kích thước tương đối lớn, dễ bị protease phân cắt. Đồng thời khả năng bám dính của nó lên glutathione chỉ xảy ra ở dạng cấu hình bình thường. Do vậy, quá trình tinh chế phải diễn ra trong điều kiện tự nhiên để GST có thể giữ nguyên cấu hình. Không giống đuôi polyhistidine tương tác không đặc hiệu với nikel làm giảm tính chuyên biệt, ligand glutathione bám rất chuyên biệt lên GST, do đó tính chọn lọc của phương pháp tinh chế này rất cao.
Sau khi tinh chế có thể dễ dàng loại bỏ GST nhờ vị trí cắt của TEV. Bên cạnh đó, các protein dung hợp với đuôi GST được tăng khả năng tan.