a. Tạo phản ứng nối pVFT-hab và fljB
Sản phẩm cắt của plasmid pVFT-hab và đoạn gen fljB được nối bằng T4 DNA ligase. Enzyme này giúp hình thành liên kết phosphodiester giữa nhóm phosphate ở đầu 5’ với nhóm –OH ở đầu 3’. Plasmid thu nhận được được đặt tên là pVFT-fljB-
hab. Thành phần phản ứng nối pVFT-hab và fljB:
MiliQ 4,5μl Buffer T4 ligase 10X 1μl Gen fljB 3μl Plasmid pVFT-hab 1μl Enzyme T4 ligase 0,5μl Tổng thể tích 10μl
Phản ứng nối được thực hiện ở 10-20oC trong 4 giờ.
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 38
- Cấy 10ml dịch nuôi cấy E. coli DH5α qua đêm vào 100ml LB, nuôi cấy lắc ở 37oC đến OD = 0,4 – 0,6 rồi ủ đá 20 phút.
- Ly tâm thu sinh khối 4.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC.
- Rửa sinh khối bằng 30ml hỗn hợp dung dịch MgCl2 80mM và CaCl2 20mM, ly tâm thu sinh khối 4.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC.
- Huyền phù nhẹ sinh khối trong 3ml CaCl2 100mM lạnh và 1ml glycerol 80% lạnh. Chuyển dịch tế bào vào các eppendorf (200µl/ eppendorf) và giữ tế bào khả nạp ở -80oC để sử dụng.
- Cho vào eppendorf 100μl tế bào khả nạp và 10μl sản phẩm nối. Mẫu được xử lý gây sốc nhiệt: 4oC - 10 phút; 42oC - 90 giây; 4oC - 15 phút.
- Cho 1ml môi trường LB vào eppendorf, lắc ở 37oC trong 15 phút.
- Ly tâm 4.000 vòng/phút, 5 phút. Hút bỏ 800µl dịch môi trường.
- Trải dịch vi khuẩn lên đĩa LB-Kan30, ủ ở 37oC, 16 giờ.
c. Sàng lọc và kiểm tra dòng tế bào E. coli DH5α/ pVFT-fljB-hab
Do sản phẩm nối giữa plasmid pVFT-hab và gen fljB là một hỗn hợp nhiều kiểu kết hợp, đồng thời plasmid pVFT có chứa gen kháng sinh kháng kanamycin, nên sau khi thực hiện quá trình biến nạp, các khuẩn lạc mọc được trên môi trường LB- Kan30 cần được sàng lọc và kiểm tra lại bằng PCR khuẩn lạc, PCR plasmid và giải trình tự các plasmid pVFT-hab có mang gen fljB.
c.1.Phản ứng PCR khuẩn lạc
Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc như sau:
MiliQ 7,5l
Buffer Taq 10X (không có MgCl2) 3l
MgCl2 (25mM) 1,5l
dNTP (8mM) 1,5l
Mồi 5’ F 0,5l
Mồi 3’ R 0,5l
Sinh khối khuẩn lạc ---
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 39
Tổng thể tích phản ứng 15l
Cho dịch phản ứng vào eppendorf 0,2ml. Sau đó dùng tăm vô trùng chấm lên khuẩn lạc mọc trên đĩa kháng sinh kanamycin. Sau đó, chuyển nhẹ nhàng sinh khối vi khuẩn vào dịch PCR.
Các cặp mồi F và R: fljB-F và fljB-R, fljB-F và hab-R.
Sản phẩm PCR được chạy điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Những khuẩn lạc cho kết quả dương tính được chọn lọc nuôi cấy và tách plasmid để tiến hành kiểm tra các bước tiếp theo.
c.2.Phản ứng PCR plasmid pVFT-fljB-hab
- Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy trong 5ml LB-Kan 30, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC.
- Thu sinh khối và tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS-kiềm. Plasmid thu nhận được dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR. Thành phần phản ứng PCR như sau:
MiliQ 6,5l
Buffer Taq 10X (không có MgCl2) 3l
MgCl2 (25mM) 1,5l
dNTP (8mM) 1,5l
pVFT-fljB-hab 1l
Mồi 5’ F 0,5l
Mồi 3’ R 0,5l
Taq DNA polymerase (1u/l) 0,5l
Tổng thể tích phản ứng 15l
Các cặp mồi F và R: fljB-F và fljB-R, fljB-F và hab-R, hab-F và hab-R. Chương trình phản ứng PCR tương tự như trường hợp PCR khuẩn lạc.
Các sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%.
c.3.Giải trình tự và phân tích
Các plasmid đã được kiểm tra qua các bước trên sẽ được giải trình tự vùng mang gen fljB-hab theo phương pháp Sanger cải tiến trên máy Big Dye TM
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 40
terminator bởi công ty Macrogen (Hàn Quốc). Trình tự đoạn gen fljB-hab của vector pVFT-fljB-hab, được so sánh với trình tự gen mã hóa fljB-hab đã được công bố trên ngân hàng gen.