a. Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB
Trong vector pVFT-fljB-hab thì các đoạn gen fljB-hab được đặt giữa trình tự MCS và nằm sau gen GST. Vector này mang khung đọc mở mã hóa cho protein GST
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 41
nên các đoạn gen sẽ được phiên mã và dịch mã cùng với protein GST, tạo protein dung hợp GST-H:1,2-HAeB. Khung đọc mở này được kiểm soát bởi promoter tac. Ở điều kiện bình thường, promoter tac bị kiểm soát bởi repressor tạo ra từ gen lacI. Khi có cảm ứng IPTG vào môi trường nuôi cấy, IPTG sẽ bất hoạt repressor, promoter sẽ được hoạt hóa, khởi động quá trình phiên mã và dịch mã các gen sau promoter này, tạo các protein dung hợp với GST.
Hoạt hóa một khuẩn lạc E. coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp trong 10ml môi trường LB-Kan30 ở 37oC, lắc qua đêm
Cấy chuyền từ ống falcon hoạt hóa qua đêm vào 200ml LB-Kan30.
Lắc ổn nhiệt ở 37oC đến khi OD600 của dịch tế bào đạt khoảng 0,8 – 0,9.
Bổ sung IPTG vào mẫu để cảm ứng sao cho nồng độ cuối 0,3mM và tiếp tục lắc ở 25oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 4 giờ.
Ly tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút, ở nhiệt độ phòng, sau đó thu sinh khối.
Rửa sinh khối tế bào 2 lần với nước cất, ly tâm 6.000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ phần dịch.
Phá tế bào và tiến hành điện di trên gel SDS-PAGE.
Sự biểu hiện của protein mục tiêu sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng thể kháng GST.
Tiến hành tương tự với mẫu đối chứng âm là tế bào E. coli BL21(DE3)/pVFT-
fljB-hab không được cảm ứng với IPTG.
b. Kiểm tra sự biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB bằng điện di SDS-PAGE
Chuẩn bị mẫu điện di SDS-PAGE:
-Mẫu sinh khối được xử lý phá tế bào trước khi điện di: bằng phương pháp vi sóng (sonicate) thành 10 xung 15W, mỗi xung dài 10 giây và ngưng 20 giây giữa các xung.
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 42
-Đun ở 100oC, 30 phút, sau đó ủ ngay vào đá để biến tính protein, ủ đá 5 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi.
Chuẩn bị gel điện di
-Lần lượt đổ gel theo thứ tự: gel phân tách (separating gel) và gel gom (stacking gel) theo Bảng 2.2. Lắp lược ở phía trên gel gom. Sau khi gel đông, lấy lược ra, lắp bản gel vào bồn điện di, cho dung dịch điện di vào bồn.
-Nạp 12μl mẫu vào mỗi giếng, tiến hành điện di với hiệu điện thế là 220V và cường độ dòng điện cho mỗi giếng là 2mA.
Bảng 2.2. Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5%
Gel phân tách Gel gom
Thành phần Thể tích (l) Thành phần Thể tích (l) dH2O 2.960 dH2O 1.300 Tris – HCl 1,5M, pH 8,8 1.750 Tris – HCl 1,5M, pH 6,8 505 40% acrylamide 2,5% biSalrylamide 2.200 40% acrylamide 2,5% biSalrylamide 200 SDS 10% 35 SDS 10% 20 APS 10% 35 APS 10% 10 TEMED 2,8 TEMED 1
Tiến hành điện di SDS – PAGE:
- Nạp 12µl mẫu cảm ứng, mẫu đối chứng và 2,5µl thang protein vào các giếng. Tiến hành điện di trong điều kiện 2mA/giếng, hiệu điện thế là 220 V.
- Khi hoàn tất điện di, lấy gel ra khỏi kính, cắt bỏ phần gel gom, nhuộm phần gel phân tách với dung dịch nhuộm trong 1 giờ. Giải nhuộm bằng dung dịch giải nhuộm, thay dần dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu và vạch protein hiện rõ.
c. Khẳng định sự biểu hiện protein dung hợp bằng Western Blot
Protein kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB ở dạng dung hợp với GST; do đó có thể xác định sự hiện diện của protein mục tiêu gián tiếp thông qua việc phát hiện protein GST. Để phát hiện GST, thực hiện lai Western Blot với kháng thể anti-GST. Sau đó, sử dụng kháng thể thứ cấp anti-Ig mouse-HRP để phát hiện phản ứng chuyên biệt giữa kháng thể anti-GST với GST. Khi HRP gặp cơ chất H2O2 và luminol, HRP sẽ thủy phân H2O2 và đồng thời ôxi hóa luminol. Luminol bị ôxi hóa ở trạng thái
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 43
không bền sẽ phát ra ánh sáng để trở về trạng thái bền hơn. Ánh sáng này có bước sóng ngắn sẽ làm cháy phim hình thành vệt trên phim. Như vậy, chỉ có những vị trí mang protein mục tiêu (GST hay protein dung hợp với GST) mới tạo vệt trên phim.
Tiến hành điện di SDS-PAGE với các mẫu như trên cùng với thang prestained (2,5l). Điện di với điện thế 220V, 2mA/giếng, 1 giờ.
Ngâm giấy thấm, màng lai nitrocellulose và gel trong dung dịch Towbin trong 10 phút, lắc nhẹ.
Đặt tất cả vào bộ chuyển màng theo thứ tự: cực dương - xốp đệm - giấy thấm - màng nitrocellulose - gel - giấy thấm - xốp đệm - cực âm như trên hình, với hiệu điện thế 10V, cường độ 100mA trong 30 phút.
Màng được đặt trong sữa gầy, lắc nhẹ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng hay ủ qua đêm ở 4oC.
Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
Bổ sung 15ml kháng thể đặc hiệu kháng protein GST được pha loãng trong PBST, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
Bổ sung 15ml kháng thể thứ cấp anti-Ig mouse-HRP được pha loãng trong PBST, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1giờ.
Lắc và rửa màng lai 5 lần với 15-20ml PBST/lần, mỗi lần 5 phút.
Đặt màng lai vào một bao nylon sạch. Nhỏ đều dung dịch phát hiện lên màng, đặt bao nylon có chứa màng lai vào hộp ép phim, mang vào phòng tối, ép phim lên màng lai, để yên trong tối khoảng 30 phút. Sau khi ép xong nhúng phim vào dung dịch developer đến khi thấy vạch đen xuất hiện. Sau đó, nhúng vào dung dịch Fixer cho đến khi miếng phim trở nên trong hơn. Rửa phim lại bằng nước máy, phơi khô.
2.2.7. Tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB trong chủng E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab
a. Tối ưu hóa nồng độ chất cảm ứng IPTG
IPTG là chất cảm ứng cho sự biểu hiện protein GST-H:1,2-HAeB trong chủng chủ E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab. Tuy nhiên, đây cũng là một chất gây độc đối
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 44
với tế bào nếu nồng độ vượt quá ngưỡng trong tế bào. Ngược lại, nếu nồng độ IPTG quá thấp trong môi trường cảm ứng thì tế bào sẽ không đáp ứng mạnh, lượng protein tái tổ hợp được tạo thành không cao. Do đó, việc khảo sát nồng độ IPTG thích hợp khi cảm ứng được tiến hành nhằm xác định nồng độ IPTG tối ưu cho sự biểu hiện protein GST-H:1,2-HAeB tái tổ hợp.
Thực hiện tương tự như mục 2.2.6.a với sự cảm ứng ở nồng độ IPTG là 0,1mM; 0,3mM; 0,5mM; 0,7mM và 0,9mM trong 4 giờ.
Đo OD600 của các dịch vi khuẩn sau cảm ứng và ghi nhận kết quả.
Tiến hành thu mẫu và xử lý mẫu tương tự như mục 2.2.6.a.
Tiến hành điện di SDS-PAGE và đánh giá sự biểu hiện của protein tái tổ hợp với mỗi nồng độ cảm ứng của IPTG.
Xác định phần trăm protein tái tổ hợp trên protein tổng bằng phần mềm Quantity One ứng với mỗi nồng độ IPG cảm ứng.
So sánh hiệu quả cảm ứng, kết quả điện di SDS-PAGE và kết quả xác định phần trăm protein tái tổ hợp trên protein tổng bằng phần mềm Quantity One. Từ đó, chúng tôi xác định được nồng độ IPTG tối ưu cho sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab.
b. Tối ưu hóa nhiệt độ cảm ứng
Nhiệt độ cảm ứng có ảnh hưởng đến việc tạo thể vùi và làm ảnh hưởng đến lượng protein thu được ở pha tan. Việc khảo sát nhiệt độ cảm ứng nhằm xác định nhiệt độ cảm ứng tối ưu cho sự biểu hiện protein GST-H:1,2-HAeB tái tổ hợp trong tế bào chất của chủng chủ E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab.
Thực hiện tương tự như mục 2.2.6 với sự cảm ứng ở các nhiệt độ 20oC; 25oC; 30oC và 37oC trong 4 giờ.
Đo OD600 của các dịch vi khuẩn sau cảm ứng và ghi nhận kết quả.
Tiến hành thu mẫu và xử lý mẫu tương tự như mục 2.2.6.b.
Tiến hành điện di SDS-PAGE và đánh giá sự biểu hiện của protein tái tổ hợp với mỗi nhiệt độ cảm ứng.
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 45
Xác định phần trăm protein tái tổ hợp trên protein tổng bằng phần mềm Quantity One ứng với mỗi nhiệt độ cảm ứng.
So sánh hiệu quả cảm ứng, kết quả điện di SDS-PAGE và kết quả xác định phần trăm protein tái tổ hợp trên protein tổng bằng phần mềm Quantity One. Từ đó, chúng tôi xác định được nhiệt độ cảm ứng tối ưu cho sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab.
c. Tối ưu hóa tốc độ lắc khi cảm ứng
Tốc độ lắc có ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh của E. coli và do đó tốc độ lắc khi cảm ứng sẽ làm ảnh hưởng đến lượng protein tái tổ hợp được sinh tổng hợp trong
E. coli. Việc khảo sát tốc độ lắc khi cảm ứng được tiến hành nhằm xác định tốc độ lắc tối ưu cho sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào chất của chủng E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab.
Thực hiện tương tự như mục 2.2.6 với sự cảm ứng ở các tốc độ lắc 150 vòng/phút; 200 vòng/phút và 250 vòng/phút trong 4 giờ.
Đo OD600 của các dịch vi khuẩn sau cảm ứng và ghi nhận kết quả.
Tiến hành thu mẫu và xử lý mẫu tương tự như mục 2.2.6.b.
Tiến hành điện di SDS-PAGE và đánh giá sự biểu hiện của protein tái tổ hợp với mỗi tốc độ lắc khi cảm ứng.
Xác định phần trăm protein tái tổ hợp trên protein tổng bằng phần mềm Quantity One ứng với mỗi tốc độ lắc khi cảm ứng.
So sánh hiệu quả cảm ứng, kết quả điện di SDS-PAGE và kết quả xác định phần trăm protein tái tổ hợp trên protein tổng bằng phần mềm Quantity One. Từ đó, chúng tôi xác định được tốc độ lắc tối ưu cho sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab.
d. Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB ở điều kiện tối ưu hóa
Các điều kiện cảm ứng biểu hiện GST-H:1,2-HAeB trong E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab đã tối ưu hóa được dùng để cảm ứng biểu hiện và thu nhận epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 46
Tiến hành cảm ứng sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB trong chủng E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab (tương tự như mục 2.2.6) với các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu hóa.
Thu nhận và xử lý mẫu như tương tự như mục 2.2.6.b.
Tiến hành di SDS-PAGE và định lượng bằng phần mềm Quantity One để đánh giá sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB tái tổ hợp trong tế bào chất E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab ở các điều kiện đã được tối ưu hóa.
So sánh sự khác biệt về khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng tan ứng với điều kiện đã tối ưu hóa và điều kiện cảm ứng ban đầu.