Để tiến hành sàng lọc và kiểm tra các thể biến nạp dự tuyển thu được trên, chúng tôi tiến hành PCR khuẩn lạc các khuẩn lạc biến nạp này bằng hai cặp mồi đặc hiệu là fljB-F, fljB-R và fljB-F, hab-R. Phản ứng PCR với plasmid pGEX-fljB và cặp mồi đặc hiệu fljB-F và fljB-R được dùng làm đối chứng dương. Kết quả điện di được trình bày trên Hình 3.4.
Ở giếng 2 là mẫu đối chứng dương (pGEX-fljB/fljB-F,fljB-R) có một vạch có kích thước gần bằng vạch 1.500bp của thang chuẩn, tương ứng với kích thước lý thuyết của gen fljB (1.541bp) trong plasmid pGEX-fljB. Ở giếng 3 và 4 (giếng 3,
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 56
DH5α/pVFT-fljB–hab/fljB-F, fljB-R; giếng 4, DH5α/pVFT-fljB–hab/fljB-F, fljB-R) xuất hiện vạch gần bằng vạch 1.500bp của thang chuẩn, đồng thời tương ứng với vạch ở giếng 2. Ở giếng 5 và 6 (giếng 5, DH5α/pVFT-fljB–hab/fljB-F, hab-R; giếng 6,
DH5α/pVFT-fljB–hab/fljB-F,hab-R) xuất hiện vạch có kích thước cao hơn vạch 1.500bp của thang chuẩn, tương ứng với kích thước cộng gộp lý thuyết của 2 gen fljB
và hab (1.616bp).
Hình 3.4.Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng E. coli DH5α/pVFT-fljB-hab
1, Thang chuẩn 1Kb; 2, pGEX-fljB/fljB-F,fljB-R; 3, DH5α/pVFT-fljB– hab/fljB-F, fljB-R; 4, DH5α/pVFT-fljB–hab/fljB-F, fljB-R; 5, DH5α/pVFT-
fljB–hab/fljB-F, hab-R; 6, DH5α/pVFT-fljB–hab/fljB-F,hab-R
Các dòng vi khuẩn dương tính được nuôi cấy và tách plasmid để kiểm tra trong bước tiếp theo. Plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc dương tính được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả được trình bày trong Hình 3.5.
Ở giếng 2 là sản phẩm PCR plasmid pVFT-fljB-hab cho ra vạch có kích thước gần bằng vạch 1.500bp của thang chuẩn. Điều này tương ứng với kích thước lý thuyết của gen fljB (1.541bp). Ở giếng 3 (pVFT-fljB–hab/ fljB-F, hab-R) có vạch cao hơn vạch 1.500bp của thang chuẩn, tương ứng với kích thước cộng gộp lý thuyết của 2 gen
fljB và hab (1.616bp). Để có thể chắc chắn hơn, chúng tôi tiến hành kiểm tra đoạn gen
hab trong plasmid tái tổ hợp bằng cặp mồi hab-F và hab-R (giếng 5). Kết quả ở giếng 5 cho một vạch thấp hơn vạch 100bp của thang chuẩn. Điều này tương ứng với kích thước lý thuyết của gen hab (75bp). Các kết quả trên cho phép chúng tôi kết luận đã dòng hóa thành công plasmid pVFT-fljB-hab trong chủng E. coli DH5α.
Luận văn thạc sĩ Kết quả - Biện luận
Trang 57
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid kiểm tra các dòng E. coli DH5α/pVFT-fljB-hab
1,Thang chuẩn 1Kb; 2,pVFT-fljB-hab/fljB-F,fljB-R; 3,pVFT-fljB–hab/fljB- F, hab-R; 4,Thang chuẩn 100bp; 5,pVFT-fljB-hab/hab-F, hab-R