HAeB
a. Thu nhận plasmid pVFT-hab bằng phương pháp SDS-kiềm
-Nuôi cấy dòng khuẩn lạc E. coli DH5α/pVFT-hab trong 5ml môi trường LB chứa kháng sinh kanamycine với nồng độ là 30µg/ml, lắc ở 37oC, qua đêm.
-Ly tâm thu sinh khối E. coli ở 10.000 vòng/phút, 5 phút.
-Thêm 100µl dung dịch I vào eppendorf chứa sinh khối, vortex kỹ.
-Tiếp tục thêm 200µl dung dịch II (pha trước khi dùng), đảo nhẹ vài lần và để ở -20oC, 5 phút.
-Sau đó thêm 150µl dung dịch III lạnh, đảo nhẹ và để ở -20oC, 5 phút.
-Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC; thu dịch nổi vào một eppendorf khác. Bổ sung 2µl RNase (10mg/ml) vào eppendorf chứa dịch nổi, ủ 37oC trong 2-3 giờ.
-Thêm dung dịch phenol:chloroform theo tỷ lệ 1:1 (250µl phenol:250µl chloroform), đảo nhẹ. Ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. Thu dịch nổi vào các eppendorf sạch.
-Tủa plasmid với 1ml ethanol tuyệt đối lạnh, vortex nhẹ. Sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Rửa tủa bằng ethanol 70% lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút, 5 phút, 4oC. Thu mẫu.
Luận văn thạc sĩ Vật liệu – phương pháp
Trang 37
-Sản phẩm plasmid được đo nồng độ bằng máy Nanodrop® và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.
b. Xử lý plasmid pVFT-hab bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI và SalI
Plasmid pVFT-hab được thu nhận ở trên sẽ được xử lý với cùng hai loại enzyme cắt giới hạn là EcoRI và SalI. Hai enzyme này sau khi cắt sẽ tạo sản phẩm là DNA đầu dính. Thành phần phản ứng cắt plasmidpVFT-hab:
Buffer O 1μl pVFT-hab 5μl EcoRI 0,5μl SalI 0,5μl Mili Q 3μl Tổng thể tích 10μl
Các thành phần của phản ứng được cho vào eppendorf 1,5ml, ủ ở 37oC trong 4 giờ. Sau đó, lấy mẫu đem điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. Sau đó sản phẩm cắt được tinh sạch bằng bộ kit EZ-10 Spin Column DNA PCR purification.