Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
s. Aureus có trong thịt lợn bày bán tại một số chợ trên địa bàn tỉnh
3.6. Phương pháp nghiên cứu
3.6.6. Phương pháp xác định khả năng sinh độc tố của các vi khuẩn phân
lập được
- Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh độc tố của vi khuẩn E.coli, S.aureus và Salmonella phân lập được bằng phản ứng khuếch tán trong da thỏ (Intradermal Test).
Vi khuẩn cần xác định độc tố được cấy vào trong môi trường BHI với liều lượng 30 ml thực hiện trong bình tam giác 100ml, giữ ở nhiệt độ ở 370C có lắc. Sau 3h nuôi cấy bổ sung lincomycin vào bình với nồng độ môi trường cuối cùng đạt 0,1 mg/1ml và thực hiện nuôi cấy tiếp đủ 24h.
Đem canh trùng ly tâm 2.000 vòng/phút bỏ cặn lấy nước trong chia làm 2 phần đều nhau:
- Phần 1 bảo quản ở nhiệt độ 40C để thử độc tố không chịu nhiệt.
- Phần 2 còn lại đem đun cách thuỷ 800C trong 30 phút rồi bảo quản ở 40C, dùng để thử độc tố chịu nhiệt.
Dùng thỏ khoẻ mạnh (3kg), cắt hết lông ở vùng lưng, dùng kem rụng lông để làm sạch rồi chia ra thành các ô vuông, mỗi cạnh 2 cm. Chính giữa mỗi ô trên da thỏ tiêm nội bì 0,1 ml độc tố vi khuẩn đã chuẩn bị (mỗi mẫu tiêm 2 vị trí) đối chứng dùng nước muối sinh lý và môi trường BHI.
Sau khi tiêm 18h với thỏ tiêm độc tố không chịu nhiệt và sau 2h với độc tố chịu nhiệt, tiêm tĩnh mạch tai thỏ Evan Blue liều 40mg/kg thỏ thí nghiệm nuôi tiếp 2 giờ nữa và đọc kết quả.
- Phản ứng dương tính khi ô da thỏ có màu xanh của Evan Blue với diện tích bằng hoặc lớn hơn 16mm2.
- Phản ứng âm tính khi ô da thỏ không có màu xanh.
- Phản ứng nghi ngờ khi ô da thỏ có màu xanh với diện tích nhỏ hơn 16 mm2 sau đó giết thỏ, lột da đọc kết quả bên trong.
- Phản ứng nghi ngờ khi ô da thỏ có màu xanh với diện tích nhỏ hơn 16 mm2 sau đó giết thỏ, lột da đọc kết quả bên trong. cấy thuần khiết trên môi trường thạch 24h ở 370C, sau đó rửa mặt thạch bằng nước muối sinh lý và thu lấy huyễn dịch vi khuẩn. Pha huyễn dịch để có nồng độ 5 108 vi khuẩn/ml (Đếm số lượng trên thạch thường, cách làm giống như phần