2) Ý nghĩa thực tiễn:
2.3.6Điện di SDS-PAGE
Cách tiến hành điện di SDS-PAGE 12%
Nguyên lý:SDS có tác dụng biến tính và tích điện cho phân tử protein. Độ tích điện tỷ lệ với trọng lượng phân tử của chúng. Dưới tác dụng của điện trường, các phân tử chuyển động về cực dương với tốc độ tỷ lệ nghịch với trọng lượng phân tử của chúng. Các phân tử nhỏ chuyển động nhanh, các phân tử lớn chuyển động chậm. Từ đó chúng sẽ phân bố ở các vị trí khác nhau trên bản điện di. Protein trong gel polyacrylamide được phát hiện bằng cách nhuộm với Coomasie Brilliant Blue (CBB) và quan sát bằng mắt thường.
Qui trình
Bước 1: Chuẩn bị gel polyacrylamide 15%
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất. Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nýớc chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làm lại.
Đổ gel theo công thức:
Bảng 2.4. Công thức gel polyacrylamide 15%
Thành phần Separating gel (15%) Stacking gel (5%)
DW 1,25 ml 0,88 ml Acrylamide (30%) 2,5 ml 0,26 ml Separating 1,25 ml - Stacking - 0,38 ml TEMED 7,5 µl 2 µl APS 45 µl 12 µl
Bước 2: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dýới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V cung cấp ion cho điện trường hoạt động).
Bước 3: Tra mẫu: Dùng Hamilton syringe lấy 20 µL (30 µg protein) sản phẩm protein kháng nguyên mỗi loại, trộn với 5 µl chỉ thị màu (Loading dye 5X) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong gel.
Bước 4: Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 6 µl chỉ thị phân tử (Protein marker) thường dùng ở đây là chỉ thị protein “SDS-PAGE Molecular Weight Standards,Low Rang (Bio Rad) tạo thành 7 phân đoạn có độ dài từ 6,25 – 97 kDa.
Bước 5: Nối hệ thống điện di với nguồn điện, protein kháng nguyên sẽ chuyển dịch từ cực âm đến cực dương. Chạy điện di ở hiệu thế 60 - 100 V trong 2,5 - 4,5 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu).
Bước 6: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút và sau đó rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành và chụp ảnh giữ mẫu kiểm tra.