2) Ý nghĩa thực tiễn:
3.7.KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG SINH
SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E. COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP
3.7.1. Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau
Mỗi một loại tế bào vi khuẩn khác nhau sẽ có một môi trường thích hợp nhất cho sự sinh trưởng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã hóa kháng nguyên eltA trên các môi trường khác nhau (LB, TB, SOC, SOB và YJ) trong cùng điều kiện (tỷ lệ tiếp giống 2%, sinh trưởng ở 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút). Sau 10 giờ nuôi cấy, khả năng sinh trưởng của vi khuẩn E. coli được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 600nm.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy ở các môi trường khác nhau thì mật độ tế bào khác nhau sau 10 giờ nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn mang gene tái tổ hợp sinh trưởng mạnh nhất sau 10 giờ nuôi cấy trong môi trường YJ, tiếp đến là các môi trường LB và TB cũng cho giá trị OD đo được tương đối cao. Môi trường SOC và SOB không thích hợp cho việc nuôi cấy chủng vi khuẩn này.
Bảng 3.1. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các môi trường khác nhau
Môi trường Mật độ tế bào OD600 LTA LB 2,577c TB 2,655b YJ 2,880a SOC 1,479e SOB 2,413d
* Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê theo Duncan’s test (p<0,05). Chú thích này dùng chung cho các bảng tiếp theo
3.7.2. Ảnh hưởng của các tỷ lệ tiếp giống khác nhau
Xác định tỷ lệ tiếp giống là rất cần thiết để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng diễn ra hiệu quả. Khi mật độ tế bào trong bình nuôi cấy quá cao hoặc quá thấp đều làm cho tế bào sinh trưởng kém (Narayanaswany, 1994). Mật độ ban đầu thấp có thể dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng hàm mũ; trong khi đó, nếu mật độ tế bào ban đầu cao hơn có thể nhanh chóng dẫn đến pha tử vong (Ling và cs 2008).
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống lên sinh trưởng của tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp cho thấy, tế bào vi khuẩn E. coli sinh trưởng tốt với tỷ lệ tiếp giống ban đầu là 1% trong bình tam giác thể tích 250 ml, chứa 50 ml môi trường và sau 8 giờ nuôi. Trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng tỷ lệ tiếp giống là 1% để khảo sát ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy khác lên sinh trưởng của tế bào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp.
Bảng 3.2. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau
Tỷ lệ tiếp giống (%) Mật độ tế bào (OD600) LTA 0,1 1,957e 0,5 2,276c 1 2,524a 2 2,463b 3 2,321c 4 2,279c 5 2,220d
3.7.3. Ảnh hưởng của các tốc độ lắc khác nhau
Tốc độ lắc ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng tế bào do liên quan đến việc cung cấp oxy và chất dinh dưỡng. Lượng oxy trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng quá trình trao đổi chất của tế bào thực vật. Lượng oxy này chủ yếu phụ thuộc vào lớp không khí trên bề mặt môi trường. Môi trường lỏng được trộn đều sẽ tăng tốc độ hòa tan của oxy, đồng thời tạo điều kiện dễ dàng cho tế bào hấp thụ chất dinh dưỡng. Nếu tốc độ lắc quá nhanh làm môi trường nuôi cấy bị tạo nhiều bọt, làm giảm
khả năng tiếp xúc của tế bào đối với các thành phần của môi trường, ảnh hưởng đến sự hô hấp của tế bào.
Tốc độ sinh trưởng của tế bào sẽ tăng khi tăng tốc độ lắc đến một giới hạn thích hợp, tuy nhiên khi tốc độ lắc quá cao sẽ ức chế sinh trưởng do tế bào bị biến dạng gây nên hiện tượng tự phân làm chết tế bào (Narayanaswany, 1994), (Ziv, 2000). Nếu tốc độ lắc thấp hoặc cao quá (80 và 335 vòng/phút) đều bất lợi cho sinh trưởng của tế bào. Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy, sinh trưởng của tế bào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml cũng chịu ảnh hưởng đáng kể khi thay đổi tốc độ lắc.
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường YJ có bổ sung Kanamycin, với tốc độ lắc thay đổi từ 150 đến 250 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào sau 10 giờ nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.3.
Nhìn chung, tốc độ lắc đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào E. coli tái tổ hợp. Với tốc độ lắc tăng từ 150 đến 200 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần lên và đạt cực đại là 2,880 tế bào/ml. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơn (220-250 vòng/phút), tế bào sinh trưởng chậm lại.
Tốc độ lắc 200 vòng/phút cũng được nhiều tác giả sử dụng trong nhân giống E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp: Nguyễn Thị Hoài Thu (2014) khi nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp SEB (Staphylococcal enterotoxin B) dạng không độc để làm nguyên liệu cho việc chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố SEB. Bạch Thị Như Quỳnh và cs (2011) khi biểu hiện protein GP41 của virus HIV trong tế bào vi khuẩn E. coli. Hay như trong nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp 31-E của Eimeria trong E. coli BL21 (DE3) của Đinh Thị Bích Lân và cs (2016) cũng cho thấy ở tốc độ lắc 200 vòng/phút, mật độ tế bào đo được là cực đại OD600=3,008.
Bảng 3.3. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các tốc độ lắc khác nhau
Tốc độ lắc (Vòng/phút) Mật độ tế bào LTA 150 2,372c 180 2,590b 200 2,880a 220 2,082e 250 2,183d
3.8. KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG CHỦNG E. BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG CHỦNG E. COLI BL21(DE3)
3.8.1. Kết quả thăm dò thời gian cảm ứng tối ưu
Thông thường, tế bào chỉ sinh trưởng đến một nồng độ nhất định rồi dừng lại. Nếu thu tế bào quá muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lượng protein tái tổ hợp trong tế bào giảm đi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thu tế bào theo các khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ và 16 giờ để khảo sát xem thời gian thích hợp nhất cho cảm ứng biểu hiện là lúc nào. Sinh khối tế bào thu được, tiến hành tách chiết protein và điện di trên gel polyacrylamide 15%. Kết quả thể hiện trên hình 3.11 cho thấy protein dung hợp 6xHis-LTA bắt đầu tổng hợp sau 2 giờ cảm ứng và tăng dần đạt giá trị cao nhất sau 6 giờ. Do vậy, thời gian 6 giờ được chúng tôi sử dụng thu mẫu sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG (1 mM) trong 50 ml môi trường YJ. Khi biểu hiện protein dung hợp IFN-CSP/pET-21b trong tế bào E. coli
BL21 (DE3), Lu và cs (2015) cũng cho thấy 6 giờ là thời điểm tối ưu nhất cho sự biểu hiện này.
Hình 3.11. Ảnh điện di thăm dò thời gian cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). 2, 4, 6,
8, 10, 12, 14 và 16: là thời gian cảm ứng IPTG.
3.8.2. Kết quả thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và trạng thái biểu hiện của protein tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện. Trong đó, nồng độ chất cảm ứng có ảnh hưởng rất lớn. Vì vậy, trước khi biểu hiện lượng lớn, chúng tôi tiến hành thăm dò nồng độ chất cảm ứng thích hợp nhất. Trong nghiên cứu này sử dụng chất cảm ứng biểu hiện là IPTG.
M 2 4 6 8 10 12 14 16 giờ LTA 10 15 25 kDa 35
IPTG là chất cảm ứng đối với T7 promoter trong đó promoter này điều khiển trực tiếp quá trình sinh tổng hợp LTa. Vì thế nghiên cứu ảnh hưởng của dãy nồng độ IPTG khác nhau là điều rất cần thiết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
IPTG được khảo sát ở dải nồng độ từ 0,2 đến 2 mM. Kết quả (Hình 3.12) cho thấy, sau khi cảm ứng bằng IPTG dòng tái tổ hợp đã tổng hợp một lượng lớn protein có kích thước khoảng 30 kDa, đúng với kích thước dự đoán của gene tái tổ hợp. Hàm lượng protein được tổng hợp phụ thuộc vào nồng độ IPTG cảm ứng.
Hình 3.12. Ảnh điện di thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C. 0,2; 0,4; 0,6,
0,8; 1,0; 1,2; 1,5 và 2,0: là nồng độ chất cảm ứng IPTG.
Dựa trên ảnh điện di có thể thấy, mức độ biểu hiện của eltA thay đổi theo nồng độ chất cảm ứng IPTG, khi nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3)/pET200/D-TOPO có cảm ứng bằng IPTG thì đều có sự xuất hiện vạch protein có kích thước khoảng 30 kDa, được xác định là protein dung hợp 6xHis-eltA. Trường hợp không có vector tái tổ hợp (NC) thì không có sự biểu hiện protein này. Khi tăng nồng độ chất cảm ứng IPTG từ 0,2 mM lên 0,8 mM thì mức độ biểu hiện 6xHis-eltA tương ứng cũng tăng lên. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ chất cảm ứng từ 0,8 mM đến 2 mM thì mức độ biểu hiện vẫn không thay đổi. Điều kiện cảm ứng 0,8 mM được chọn làm cơ sở cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lu và cs (2015) khi tối ưu các điều kiện biểu hiện IFN-CSP trong tế bào E. coli BL21 với vector biểu hiện là pET-21b.
3.8.3. Kết quả thăm dò thành phần các môi trường tối ưu
Thành phần môi trường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy môi trường thích hợp cho nhân giống sinh khối có thể không thích hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp. Chúng tôi đã khảo sát khả năng biểu hiện của protein dung hợp 6xHis-eltA
M NC 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 2 mM LTA 10 15 25 kDa
trên 5 loại môi trường với các thành phần khác nhau (LB, YJ, TB, HSG và M9ZB cải tiến). Thí nghiệm được tiến hành trong cùng một điều kiện (cảm ứng với 0,8 mM IPTG, lắc 200 vòng/phút, ở 37ºC trong thời gian 6 giờ) trên gel SDS-PAGE chỉ ra rằng môi trường YJ cho kết quả biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa tốt nhất, tiếp đến là môi trường HSG và M9ZB cải tiến, môi trường LB và TB không thích hợp cho biểu hiện sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp LTa trong quy mô phòng thí nghiệm nên cho hàm lượng kháng nguyên thấp nhất (hình 3.13). Thăm dò thành phần môi trường biểu hiện cho sản xuất protein tái tổ hợp được nhiều tác giả nghiên cứu. Chẳng hạn, Đinh Thị Bích Lân và cs (2016) cho thấy kháng nguyên 31-E biểu hiện mạnh trong môi trường LB so với các môi trường TB, YJ, SOB và SOC , Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2014) cho thấy môi trường thích hợp cho sự biểu hiện của kháng nguyên bám dính K88-1NT là M9ZB cải tiến.
Hình 3.13. Ảnh điện di thăm dò thành phần các môi trường tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC1: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C. NC2: E. coli
mang vector tái tổ hợp không bổ sung chất cảm ứng IPTG sinh trưởng ở 370C. M9ZB; HSG; LB; YJ; và TB: là các môi trường biểu hiện có chứa các thành phần khác nhau.
3.8.4. Kết quả thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu
Mật độ ban đầu là một trong những yếu tố có liên quan mật thiết đến sinh khối và thời gian đạt mật độ cực đại. Xác định mật độ ban đầu thích hợp rất có ý nghĩa trong sản xuất, giúp ta tiết kiệm được thời gian và giống. Từ những lý do trên, thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sự biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa đựợc tiến hành. Để xác định được thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các mức khác nhau của mật độ tế bào đo được lúc bắt đầu cảm ứng từ 0,2 đến 3. Kết quả thu nhận được trình bày trên hình 3.14. Qua hình ảnh chúng tôi nhận thấy rằng mật độ tế bào thích hợp trước khi bổ sung chất cảm ứng IPTG (0,8 mM) trên 50 ml môi trường YJ để thu được kháng nguyên tái tổ hợp cao nhất là OD600 = 0,8. M NC1 NC2 LB TB M9ZB YJ HSG LTA 15 25 35 kDa
Hình 3.14. Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C
. 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 và 3,0: là các mật độ tế bào khác nhau trước khi bổ sung chất cảm ứng
3.8.5. Kết quả thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu
Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp ở 5 mức nhiệt độ khác nhau 160C, 200C, 250C, 300C, 370C. Kết quả thu được trên hình 3.15 cho thấy ở 160C, lượng protein biểu hiện rất ít và cao nhất ở 250C. Vì thế chúng tôi chọn nhiệt độ 250C để biểu hiện gene trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Kết quả này phù hợp với kết quả của Văn Thị Như Ngọc và cs (2007) khi biểu hiện gene HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Hamegglutinnin của virus cúm A H5N1 trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cũng đưa ra mốc nhiệt độ tối ưu cho sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp trong tế bào E. coli là 300C như Hoàng Hà và cs (2008) khi biểu hiện tiểu đơn vị p51 của enzyme phiên mã ngược của virus HIV, Tương tự, nghiên cứu của Lee và cs (2006) cũng cho thấy khi nuôi nhân giống và nuôi cảm ứng biểu hiện L-threonine trong E. coli MT201 ở quy mô phòng thí nghiệm tại 300C cho lượng L-threonine khá cao.
M NC1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 2,0 3,0 LTA 10 25 35 15
Hình 3.15. Ảnh điện di thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C. 160C, 200C,
250C, 300C, 350C và 370C: là các nhiệt độ cảm ứng khác nhau. M NC 16ºC 20ºC 25ºC 30ºC 37ºC LTA 15 25 35 kDa
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
- Tạo dòng và xác định được trình tự của đoạn gene eltA mã hóa tiểu đơn vị A của kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LT của vi khuẩn E. coli có chiều dài 798 bp.
- Biểu hiện thành công gene mã hóa kháng nguyên độc tố LTa với vector pET200/D-TOPO trong E. coli BL21 (DE3). Với môi trường nuôi cấy YJ, tỷ lệ tiếp giống 1%, tốc độ lắc 200 vòng/phút, và nuôi cấy sau 8 giờ là các điều kiện tối ưu để thu sinh khối tế bào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp.
- Protein dung hợp 6xHis- LTacó khối lượng phân tử khoảng 30 kDa, biểu hiện mạnh nhất sau 6 giờ cảm ứng ở 250C với nồng độ IPTG 0,8 mM, môi trường nuôi cấy YJ, mật độ tế bào ban đầu OD600 = 0,8.
4.2. ĐỀ NGHỊ
- Nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất vắc xin hoặc kháng thể lòng đỏ, phục vụ cho việc phòng và trị tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Hoàng Văn Quốc Chương (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, Huỳnh Văn Kháng (1996),
Bệnh ở lợn nái và lợn con, Nhà Xuất Bản Nông nghiệp, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3. Hoàng Hà, Phan Trọng Hoàng, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008), Biểu hiện tái tổ hợp và tinh sạch tiểu đơn vị p51 của enzyme phiên mã