2) Ý nghĩa thực tiễn:
2.3.3.Phân lập gene eltA bằng phản ứng PCR
Thiết kế mồi đặc hiệu cho gene eltA
Vùng gene mã hóa tổng hợp tạo kháng nguyên độc tố LTa của E. coli được chọn làm vùng đích để thiết kế cặp mồi thu nhận gene eltA. Sau khi xác định được vùng gene chỉ thị eltA, chúng tôi tiến hành thiết kế các cặp mồi (primer) đặc hiệu bằng phần mềm Plusprimer3, trình tự nucleotid được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotid của cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA
Tên mồi Trình tự nucleotid (Nu)
LTAFB 5’-CACCATGATATATAAGTTTTCCTCGATG-3’ LTARC 5’-TCATAATTCATCCCGAATTCTG-3’ Phản ứng PCR
Phản ứng PCR dùng để phân lập gene eltA của vi khuẩn E. coli được tiến hành theo phương pháp PCR chuẩn của Sambrook và cs (1989) (Sambrook và cs, 1989). Thành phần phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR phân lập gene eltA của E. coli
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
GoTag Green Master Mix, 2 X 12,5
Mồi xuôi (10 pmol/ µl) 1
Mồi ngược (10 pmol/ µl) 1
ADN khuôn mẫu (50 ng/µl) 1
Nước tinh khiết 9,5
Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Chất lượng ADN sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X (40 mM Tris-acetate, 1 mM ) ở 100 V trong 35 phút.
550C 720C 720C 40C 1 phút 10 phút 35 chu kỳ 1 phút – ∞ 940C 940C 5 phút 1 phút
Gel sau khi điện di được nhuộm bằng Ethidium bromide nồng độ 0,5 μg/ml trong thời gian 15 - 30 phút trên máy lắc nhẹ. Gel được quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại μ = 302 nm bằng hệ thống DyNA Light, Dual Intensity UV Transillumninator (Labnet).
Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được cắt ra từ gel agarose 1% và tinh sạch bằng KIT ISOLATE II PCR and Gel (BIOLINE)
1. Bổ sung 200 µl Binding Buffer (CB) cho mỗi 100 mg gel, ủ ở 500C trong 5-10 phút cho gel tan hoàn toàn.
2. Chuyển toàn bộ dịch hòa tan vào cột lọc Gel Column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây, loại bỏ dung dịch ở phía dưới cột lọc.
6. Bổ sung 700 µl đệm rửa CW (wash buffer CW) vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây, loại bỏ dung dịch ở phía dưới cột lọc.
7. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ toàn bộ ethanol có trên màng. 8. Chuyển cột lọc vào ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung 15 – 30 µl Elution buffer C, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
9. ADN tinh sạch bảo quàn -200C.
2.3.4. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gene
Tạo vector tái tổ hợp
Sản phẩm phản ứng PCR thu được sau khi tinh sạch sẽ được gắn vào vector pGEM® -T Easy Vector System theo phương pháp dòng hóa TA (TA-cloning) của hãng Invitrogen, có enzyme T4 ADN ligase làm enzyme nối.
Nguyên lý: Các nucleotid nằm ở đầu dính của một sợi ADN đơn có khả năng hình thành cầu nối hydro với các nucleotid bổ sung nằm trên đầu dính của đoạn ADN khác. Nhờ sự xúc tác của enzyme ADN ligase, cầu nối phosphodieste được hình thành giữa hai nucleotid sát cạnh nhau của hai đoạn ADN này. Kết quả là một liên kết este hình thành giữa gốc phốt phát đầu 5’ của đoạn ADN này với gốc hydroxyl đầu 3’ của đoạn kia đồng thời giải phóng ra một phân tử nước và hai sợi ADN gắn được với nhau.
Quy trình: Tùy thuộc vào nồng độ và chiều dài của các đoạn ADN cần nối mà có tỷ lệ trộn mẫu plasmid và đoạn gene mục tiêu khác nhau. Phản ứng nối ghép thường được tiến hành với tổng thể tích là 10 µl (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Đệm (2X) 5 µl
Vector pGEM®-T Easy (50 ng/µl) 1 µl
T4 ADN ligase (3U/µl) 1 µl Sản phẩm PCR (12 ng/µl) 1 µl Bổ sung nước cất vô trùng để đạt
thể tích cuối cùng 10 µl
Phản ứng được ủ 25ºC trong 1 giờ, sau đó ủ qua đêm ở 4ºC.
Biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli TOP10
Tiến hành
1. Rả đông tế bào khả biến E. coli TOP10 từ từ trong đá để tránh tế bào vở do sốc nhiệt 2. Bổ sung 10 µl sản phẩm gắn vào 200 µl tế bào khả biến nói trên và tiếp tục ủ trong đá 60 phút.
3. Sốc nhiệt 420C trong 60 giây, và chuyển nhanh vào đá khoảng 10 phút.
4. Bổ sung 800 µl môi trường Luna Broth (LB) lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong khoảng 1 giờ.
5. Lấy 100-200 µl dịch nuôi cấy tế bào trên dàn đều lên đĩa có chứa môi trường LB agar ampicillin (50 µg/ml), 30 µl X-gal (20 mg/ml) và 30 µl IPTG 100 mM và trên môi trường LB agar không bổ sung kháng sinh đối với mẫu đối chứng. Ủ đĩa ở 370
C qua đêm.
Sản phẩm của quá trình biến nạp được kiểm tra bằng phương pháp chọn lọc khuẩn lạc Xanh-trắng.
Phương pháp chọn lọc các dòng dương tính
Chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng mọc trên môi trường chọn lọc cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường LB có bổ sung 50 µg/ml kháng sinh ampicilin, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm. Sinh khối tế bào thu được tiến hành tách chiết ADN plasmid trên cột EZ-10 (EZ-10 Spin Column Plasmid ADN Minipreps kit, BS6141 (Bio Base INC). Sản phẩm plasmid sẽ được kiễm tra bằng điện di agarose 1% và kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen eltA và cặp mồi M13 được thiết kế sẵn trên vector pGEM® -T Easy (M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC-3´ và M13R: 5´CAGGAAACAGCTATGAC-3´).
Quy trình tách chiết Plasmid:
1. Sinh khối tế bào được thu nhận bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. 2. Tái huyền phù sinh khối tế bào trong 100 µl Solution I, giữ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
3. Bổ sung 1 µl VisualLyse, trộn đều, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Bổ sung 200 µl Solution II và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo lên đảo xuống 4-6 lần, sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút (Không vortex).
5. Tiếp tục bổ sung 300 µl Solution III, trộn nhẹ nhàng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
6. Ly tâm 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút.
7. Chuyển toàn bộ dịch nổi sang cột EZ-10, ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút. 8. Loại bỏ dung dịch ở phía dưới, bổ sung 750 µl Wash solution vào cột, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút (lặp lại bước 8 một lần nữa).
9. Loại bỏ dung dịch ở phía dưới cột, làm khô màng bằng cách ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút.
10. Chuyển cột lọc sang ống effendorf mới (1,5 ml), bổ sung 50 µl Elution Buffer vào chính giữa cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút, thu dịch ở phía dưới.
11. Bảo quản ADN tinh sạch ở -200C.
2.3.5. Biểu hiện gen trong vector pET200/D-TOPO
Sản phẩm PCR từ các vector pGEM®-T Easy được cắt ra trên gel agarose 0,8% và tinh sạch bằng KIT ISOLATE II PCR and Gel (BIOLINE), sau đó gắn vào vector pET200/D-TOPO (Hình 3.8A) mang promoter T7 (Invitrogen). Thành phần phản ứng gắn bao gồm: 8 ng ADN, 20 ng vector pET200/D-TOPO, 1 µl dung dịch muối, bổ sung nước vô trùng để đạt thể tích phản ứng là 6 µl. Trộn nhẹ và ủ ở 250
C trong 60 phút. Tiếp theo, phản ứng gắn được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 420
C trong 60 giây, thành phần bao gồm: 6 μl phản ứng gắn, 200 μl tế bào E. coli BL21 và 800 μl môi trường SOC (2% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm men; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; và 20 mM glucose; pH 7,0). Dung dịch biến nạp được cấy trải trên đĩa petri chứa môi trường LB đặc (1% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm men; và 1% NaCl; 1,5% agar, pH 7,0) có bổ sung 100 μg/ml Kanamycin và ủ ở 370C qua đêm. Vector pET200/D-TOPO không có khả năng tự đóng vòng, do đó những tế bào E. coli sống được trên môi trường chọn lọc (LB + kanamycin) đều mang vector pET200/D-TOPO tái tổ hợp với sản phẩm PCR (Mierendorf, 2000).
Các tế bào E. coli có vector biểu hiện mang sản phẩm PCR là đoạn mã hóa của gen kháng nguyên độc tố được nuôi trong bình tam giác chứa 250 ml môi trường YJ lỏng 100 μg/ml Kanamycin ở 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Khi mật độ tế bào của
dịch nuôi cấy đạt tới OD600 = 1,0 thì bổ sung IPTG đến nồng độ 1 mM và nuôi tiếp ở 370C. Sinh khối tế bào được thu nhận 2 giờ một lần bằng cách ly tâm trong 1 phút, 15.000 vòng/phút. Phá vỡ tế bào E. coli trong đệm 2 ml TNE (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA) + 1% Trixton X-100 và siêu âm với tần số 40 Hz xung 10 giây trong 5 phút. Dịch protein hòa tan nội bào được thu nhận bằng cách ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút.
Biểu hiện của gen kháng nguyên nội bào được phân tích bằng điện di polyacrylamide gel 15% có SDS ở 60 V. Sau đó, gel được nhuộm với Coomassie Blue R-250 và hình ảnh được phân tích bằng phần mềm Quality One (ver 4.1, Bio-Rad).
2.3.6 Điện di SDS- PAGE
Cách tiến hành điện di SDS-PAGE 12%
Nguyên lý:SDS có tác dụng biến tính và tích điện cho phân tử protein. Độ tích điện tỷ lệ với trọng lượng phân tử của chúng. Dưới tác dụng của điện trường, các phân tử chuyển động về cực dương với tốc độ tỷ lệ nghịch với trọng lượng phân tử của chúng. Các phân tử nhỏ chuyển động nhanh, các phân tử lớn chuyển động chậm. Từ đó chúng sẽ phân bố ở các vị trí khác nhau trên bản điện di. Protein trong gel polyacrylamide được phát hiện bằng cách nhuộm với Coomasie Brilliant Blue (CBB) và quan sát bằng mắt thường.
Qui trình
Bước 1: Chuẩn bị gel polyacrylamide 15%
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất. Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nýớc chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làm lại.
Đổ gel theo công thức:
Bảng 2.4. Công thức gel polyacrylamide 15%
Thành phần Separating gel (15%) Stacking gel (5%)
DW 1,25 ml 0,88 ml Acrylamide (30%) 2,5 ml 0,26 ml Separating 1,25 ml - Stacking - 0,38 ml TEMED 7,5 µl 2 µl APS 45 µl 12 µl
Bước 2: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dýới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V cung cấp ion cho điện trường hoạt động).
Bước 3: Tra mẫu: Dùng Hamilton syringe lấy 20 µL (30 µg protein) sản phẩm protein kháng nguyên mỗi loại, trộn với 5 µl chỉ thị màu (Loading dye 5X) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong gel.
Bước 4: Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 6 µl chỉ thị phân tử (Protein marker) thường dùng ở đây là chỉ thị protein “SDS-PAGE Molecular Weight Standards,Low Rang (Bio Rad) tạo thành 7 phân đoạn có độ dài từ 6,25 – 97 kDa.
Bước 5: Nối hệ thống điện di với nguồn điện, protein kháng nguyên sẽ chuyển dịch từ cực âm đến cực dương. Chạy điện di ở hiệu thế 60 - 100 V trong 2,5 - 4,5 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu).
Bước 6: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút và sau đó rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành và chụp ảnh giữ mẫu kiểm tra.
2.3.7. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp tổ hợp
Chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được nuôi trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường LB có bổ sung 50 µg/ml Km (Kanamycin). Quá trình nuôi cấy được tiến hành trong 28 giờ ở 370
C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, tỷ lệ tiếp giống là 0,1% (v/v). Sau mỗi hai giờ nuôi, dịch huyền phù tế bào của chủng E. coli BL21 tái tổ hợp được thu để xác định mật độ quang ở bước sóng 600 nm (OD600). Tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng bằng phần mềm excel để tìm thời điểm sản xuất sinh khối thích hợp.
2.3.8. Nghiên cứu Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp
Thăm dò khả năng sinh trưởng của các chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp trong các môi trường: LB, SOB, SOC, TB, và YJ. 50 ml môi trường (pH 7) có bổ sung 50 µg/ml Kanamycin được cho vào bình tam giác loại 250 ml, tỷ lệ cấy giống khảo sát từ 0,1-5% (v/v) (giống gốc (OD600 = 0,8) bảo quản ở -300C trong môi trường LB có bổ sung 30% glycerol)) (Manderson và cs, 2006). Nuôi cấy ở 370C trong thời gian thích hợp (được xác định ở đường cong sinh trưởng), tốc độ lắc từ 150-250 vòng/phút (Matsui và cs, 2007) (hình 2.2).
Thành phần các môi trường như sau:
Môi trường LB: 0,5% dịch chiết nấm men, 1% tryptone và 1% NaCl (Loc và cs, (2013).
Môi trường SOB: 2% peptone, 0,5% dịch chiết nấm men, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 và 10 mM MgSO4 (Shen và cs, 2007).
Môi trường SOC: môi trường SOB và 20 mM glucose (Shen và cs, 2007). Môi trường TB: 1,2% peptone, 2,4% dịch chiết nấm men, 72 mM K2HPO4, 17 mM KH2PO4, và 0,4% glycerol (Shen và cs, 2007).
Môi trường YJ: 2% glycerol, 1,5% tryptone, 2% dịch chiết nấm men, 0,25% K2HPO4.12H2O, 0,016% KH2PO4, 0,05% NaCl, và 0,025% MgSO4.7H2O (Yang và cs, 2008).
Môi trường M9ZB cải tiến: 1% Na2HPO4.12H2O, 0,3% KH2PO4, 0,05% NaCl, 1% (NH4)2SO4, 0,2% MgSO4.7H2O, 1,5% glucose, 1% tryptone và 1% dịch chiết nấm men (Lee và cs, 2000).
Môi trường HSG: 1,49% glycerol, 0,7% dịch chiết nấm men, 1,35% tryptone, 0,014% MgSO4.H2O, 0,15% KH2PO4, 0,23% K2HPO4, và 0,5% glycine (Miksch và cs, 2008).
Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm về khả năng sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp
THĂM DÒ TỶ LỆ TIẾP GIỐNG (0,1-5%)
- Môi trường thích hợp - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút - Nhiệt độ nuôi cấy: 370C
THĂM DÒ TỐC ĐỘ LẮC (150-250 vòng/phút)
- Môi trường thích hợp - Nhiệt độ nuôi cấy: 370C - Tỷ lệ tiếp giống thích hợp - Tốc độ lắc 200 vòng/phút
THĂM DÒ MÔI TRƯỜNG (LB, TB, SOC, SOB và YJ, 50 ml)
- Nhiệt độ nuôi cấy: 370C - Tốc độ lắc 200 vòng/phút - Tỷ lệ tiếp giống 2%
2.3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện của khángnguyênLTa khángnguyênLTa
Quy trình khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện kháng nguyên độc tố LTa của các chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được trình bày ở hình 2.3. Nuôi cấy vi khuẩn E. coli tái tổ hợp trong bình tam giác loại 250 ml chứa 50 ml môi trường dinh dưỡng (pH 7) có bổ sung 50 µg/ml Kanamycin và 1% glucose ở 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút với tỷ lệ cấy giống thích hợp.
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu sự biểu hiện của các kháng nguyên LTa
THĂM DÒ MÔI TRƯỜNG CẢM ỨNG (LB, TB, YJ, M9ZB và HSG, 50 ml)
- Tỷ lệ tiếp giống, thời gian, nồng độ IPTG thích hợp - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút - Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC - Thời điểm cảm ứng: OD600= 1,0 THĂM DÒ NỒNG ĐỘ CHẤT CẢM ỨNG IPTG (0,2-2 mM) - Môi trường cảm ứng YJ (50 ml) - Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút - Nồng độ IPTG: 1 mM
- Thời gian cảm ứng, tỷ lệ tiếp giống thích hợp - Thời điểm cảm ứng: OD600= 1,0
THĂM DÒ THỜI GIAN CẢM ỨNG (2-16 giờ)
- Môi trường cảm ứng YJ (50 ml) - Tỷ lệ tiếp giống thích hợp - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút - Thời điểm cảm ứng: OD600= 1,0 - Nồng độ IPTG: 1 mM - Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC
THĂM DÒ THỜI ĐIỂM CẢM ỨNG (OD600=0,5-4,0)
- Môi trường (50 ml), tỷ lệ tiếp giống, thời gian, nồng độ IPTG thích hợp - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút
- Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC
THĂM DÒ NHIỆT ĐỘ CẢM ỨNG (16-370C)
- Môi trường (50 ml), tỷ lệ tiếp giống, thời gian, nồng độ IPTG, thời điểm cảm ứng thích hợp
Cảm ứng biểu hiện kháng nguyên LTa với các múc thời gian 2, 4, 6, 8, 10 ,12,