2) Ý nghĩa thực tiễn:
1.3.TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E COLI
Từ đầu thập niên 1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng E. coli làm tế bào vật chủ để sản xuất các protein tái tổ hợp phục vụ trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống con người.
Protein tái tổ hợp được sản xuất ở E. coli có thể thực hiện theo ba hướng: sản xuất nội bào (tế bào chất), trong chu chất và sản xuất ngoại bào. Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp trong nội bào là chiến lược được sử dụng phổ biến nhất. Protein tái tổ hợp tạo ra có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi), do đó khuyết điểm chủ yếu của chiến lược này là hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện vượt mức. Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải được tái gấp cuộn để có hoạt tính. Nhiều cải tiến đã được tiến hành như nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp, thay thế các acid amin, sử dụng các chủng E. coli khác nhau, đồng biểu hiện với chaperone gấp cuộn, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở điều kiện stress...
Biểu hiện ở tế bào chất
Hầu hết protein được biểu hiện ở E. coli đều được thiết kế biểu hiện ở tế bào chất của tế bào. Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli gặp nhiều khó khăn như protein thường được tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính sinh học gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E. coli không có cơ chế thúc đẩy sự hình thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E. coli vẫn là phương án được sử dụng phổ biến nhất do mức độ biểu hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng đơn giản hơn. Ngoài ra, hiện nay người ta cũng phát triển nhiều phương pháp nhằm cải thiện tính tan của protein trong tể bào chất như đồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử dụng các chủng E.coli đột biến gene trx...
Biểu hiện ở chu chất
Khoang chu chất của tế bào E. coli là nơi có tính oxi hóa cao do có chứa 22 các enzyme xúc tác cho việc hình thành liên kết disulfide. Tuy nhiên trong khoang chu chất lượng protein thường được biểu hiện với hiệu suất thấp. Mặt khác, để protein có thể chuyển từ màng trong ra ngoài khoang chu chất là đoạn peptide tín hiệu. Không
phải peptide tín hiệu nào cũng hoạt động tốt trong tế bào E. coli. Khi tăng sự tổng hợp peptide tín hiệu sẽ làm giảm mức độ biểu hiện của protein để tránh tình trạng ùn tắc hệ thống vận chuyển qua màng, làm tăng sự tổng hợp protein đóng vai trò chuyển màng. Bên cạnh đó khi biểu hiện ở chu chất, protein cũng có thể tồn tại ở dạng thể vùi.
Tiết ra môi trường
E. coli tiết rất ít (hầu như không có) protein ra ngoài môi trường nuôi cấy. Protein được định hướng tiết ra ngoài môi trường sẽ phải qua hai màng: màng trong và màng ngoài của E. coli. Cơ chế chuyển qua màng là rất đặc hiệu. Người ta cho rằng có hai cách để định hướng protein được tiết ra ngoài môi trường đó là sử dụng con đường tiết sẵn thông qua việc sử dụng các đoạn peptide tín hiệu; cách thứ hai là sử dụng các yếu tố thẩm thấu ảnh hưởng tới việc tiết protein có lựa chọn nhưng lại hạn chế được tính thấm của màng ngoài. Nhìn chung protein tạo ra bằng những phương pháp này là rất hiếm gặp.
Việc sử dụng E. coli cũng có một số ưu-nhược điểm nhất định so với các hệ thống khác (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. So sánh hệ thống tế bào vật chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp (Hoàng Văn Quốc Chương, 2010)
Đặc tính E. coli Nấm men Tế bào côn trùng
Tế bào động vật
Sự tăng trưởng tế bào Nhanh (30’) Nhanh (90’) Chậm (24 giờ) Chậm (24 giờ) Môi trường tăng trưởng Đơn giản Đơn giản Phức tạp Phức tạp
Chi phí môi trường Thấp Thấp Cao Cao
Mức độ biểu hiện Cao Thấp-Cao Thấp-Cao Trung bình Biểu hiện ở ngoại bào Chu chất Môi trường
nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy Tái gấp cuộn protein Cần Cần Không cần Không cần
Glycosyl hóa liên kết N Không Mannose cao
Đơn giản, không có sialic acid
Phức tạp
Glycosyl hóa liên kết O Không Có Có Có
Phosphoryl hóa Không Có Có Có
Acetyl hóa Không Có Có Có
Acyl hóa Không Có Có Có
Hiện nay việc tạo dòng và biểu hiện gene trong E. coli được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới thực hiện.
Sau khi phân lập được đoạn gene mã hóa cho enzyme catalase bằng phản ứng PCR, Yang và cs (2003) tạo dòng vào vector pET-22b (+) và biểu hiện trong E. coli
BL21 (DE3), kết quả cho thấy enzyme catalase tái tổ hợp chiếm 24,4% hàm lượng protein tổng số sau khi cảm ứng bằng IPTG trong 3 giờ ở 370C. Như vậy, enzyme này đã có hoạt tính cao khi biểu hiện trong E. coli (Yang và cs, 2003).
Khi nghiên cứu về chức năng sinh học của protein B7-H3 trong việc hoạt hóa tế bào lympho T, Guang và cs (2004) đã tạo dòng gene B7-H3 vào vector pGEX-5X-3 và biến nạp vào E. coli (Guang và cs, 2004). Năm 2006, Zhinan và cs đã thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gene.
Human-beta-defensin-4 (hBD4) vào E. coli, là một protein có tác dụng chống nhiễm khuẩn ở người, với vector biểu hiện pET32-smhBD4 (Zhinan và cs, 2006). Cũng trong năm 2006, Jinshu và cs đưa được gene mã hóa GnRH vào hệ thống biểu hiện dựa trên T7 RNA polymerase trong vector pED-GnRH3, GnRH là hormone điều hòa quá trình tiết hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone kích thích thể vàng (LH), do vậy có ý nghĩa rất lớn trong việc điều trị bệnh liên quan đến hormone này (Jinshu và cs, 2006).
Nguyễn Thị Trung và cs (2006) đã nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Roi tái tổ hợp đặc hiệu cho Salmonella Typhimurium. Các protein tái tổ hợp được tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực, sau đó được kiểm tra khả năng liên kết với kháng thể kháng S. Typhimurium trong huyết thanh gà bằng phương pháp lai Western blot. Kết quả chỉ ra rằng các protein đều liên kết đặc hiệu với kháng thể kháng S. Typhimurium.
Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố SEB (Nguyễn Thị Hoài Thu, 2014).
Đinh Thị Bích Lân và cs (2009) cũng đã biểu hiện thành công gene kháng nguyên bề mặt SAG2 của Toxoplasma gondii trong E. coli (DH5α) để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp cho việc sản xuất que chẩn đoán nhanh (dipstick) bệnh Toxoplasmosis ở bò và ở người (Đinh Thị Bích Lân và cs, 2009). Tại Thừa Thiên- Huế, các tác giả đã dùng que chẩn đoán nhanh để nghiên cứu tình hình nhiễm
Toxoplasma gondii ở mèo và lợn, kết quả cho thấy: tỷ lệ huyết thanh dương tính với
Toxoplasma gondii ở mèo rất cao (60%) và ở lợn trung bình 38,66%. Năm 2015, nhóm tác giả cũng tạo dòng và biểu hiện thành công gene mã hóa kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà (Eimeria) trong tế bào E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện. Sắc ky lọc gel 6xHis cho thấy sản phẩm protein dung hợp 6xHis-3-1E có khối lượng phân tử vào khoảng 26 kDa (Đinh Thị Bích Lân và cs, 2015).