2) Ý nghĩa thực tiễn:
2.3.9.Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện của kháng
Quy trình khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện kháng nguyên độc tố LTa của các chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được trình bày ở hình 2.3. Nuôi cấy vi khuẩn E. coli tái tổ hợp trong bình tam giác loại 250 ml chứa 50 ml môi trường dinh dưỡng (pH 7) có bổ sung 50 µg/ml Kanamycin và 1% glucose ở 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút với tỷ lệ cấy giống thích hợp.
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu sự biểu hiện của các kháng nguyên LTa
THĂM DÒ MÔI TRƯỜNG CẢM ỨNG (LB, TB, YJ, M9ZB và HSG, 50 ml)
- Tỷ lệ tiếp giống, thời gian, nồng độ IPTG thích hợp - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút - Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC - Thời điểm cảm ứng: OD600= 1,0 THĂM DÒ NỒNG ĐỘ CHẤT CẢM ỨNG IPTG (0,2-2 mM) - Môi trường cảm ứng YJ (50 ml) - Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút - Nồng độ IPTG: 1 mM
- Thời gian cảm ứng, tỷ lệ tiếp giống thích hợp - Thời điểm cảm ứng: OD600= 1,0
THĂM DÒ THỜI GIAN CẢM ỨNG (2-16 giờ)
- Môi trường cảm ứng YJ (50 ml) - Tỷ lệ tiếp giống thích hợp - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút - Thời điểm cảm ứng: OD600= 1,0 - Nồng độ IPTG: 1 mM - Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC
THĂM DÒ THỜI ĐIỂM CẢM ỨNG (OD600=0,5-4,0)
- Môi trường (50 ml), tỷ lệ tiếp giống, thời gian, nồng độ IPTG thích hợp - Tốc độ lắc: 200 vòng/phút
- Nhiệt độ cảm ứng: 37ºC
THĂM DÒ NHIỆT ĐỘ CẢM ỨNG (16-370C)
- Môi trường (50 ml), tỷ lệ tiếp giống, thời gian, nồng độ IPTG, thời điểm cảm ứng thích hợp
Cảm ứng biểu hiện kháng nguyên LTa với các múc thời gian 2, 4, 6, 8, 10 ,12, 14, 16 giờ, nhiệt độ cảm ứng từ 16-370C và nồng độ chất cảm ứng IPTG khảo sát từ 0,2- 2 mM, mật độ tế bào trước khi bổ sung chất cảm ứng từ 0,5 – 3,0. Các môi trường được sử dụng để biểu hiện kháng nguyên LTa là LB (Loc và cs, (2013), TB (Shen và cs, 2007), YJ (Yang và cs, 2008), M9ZB cải tiến (Lee và cs, 2000) và HSG (Miksch và cs, 2008) (Hình 2.3).
2.3.10. Phương pháp sắc ký lọc gel bằng cột Ni-NTA
Sắc ký ái lực là phương pháp được ứng dụng rộng rãi để tinh chế protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao hoặc chuyên biệt của protein với các nhóm hóa học chuyên biệt. Khi nạp hỗn hợp protein vào cột, protein có khả năng nhận biết một nhóm X hay dẫn xuất của nó được gắn trên cột bằng nối cộng hóa trị. Sau đó cột được rửa để loại bỏ những protein không tạo được nối hoặc nối không đặc hiệu. Cuối cùng dung ly protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hoặc thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Trong tinh sạch protein tái tổ hợp do gene eltA mã hóa tạo thành với vector biểu hiện pET và chủng E. coli, được tạo thành ở dạng dung hợp với 6xHis. Nguyên tắc sắc ký này được trình bày trên Hình 1.1.
Hình 2.4. Sơ đồ Tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis trên hệ thống cột sắc ký ái lực Ni-NTA (Hoàng Văn Quốc Chương, 2010)
2.3.11. Xử lí thống kê
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu thực nghiệm đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng được tính giá trị trung bình và phân tích ANOVA (Duncan’test, p<0,05) bằng chương trình SAS.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ VI KHUẨN E. COLI
ADN tổng số của hệ gene của E. coli được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả tách chiết ADN tổng số được trình bày trên hình 3.1.
Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn E. coli
Kết quả điện di trên hình cho thấy ADN tổng số thu được chỉ có một băng ADN rõ nét, thể hiện chất lượng và hàm lượng ADN tổng số khá tốt. Tách chiết ADN tổng số tương đối thành công, không có ADN bị đứt gãy ADN này có thể tiếp tục sử dụng để thực hiện nhân bản thu gene mục tiêu.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE eltA BẰNG PHẢN ỨNG PCR
Trên cơ sở ADN thu được, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để thu nhận đoạn gene mong muốn. Các kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả trình bày ở hình 3.2.
Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA trên gel agarose 1%. Giếng M: Khối lượng thang chuẩn ADN 100 -1000 bp (BioBase); giếng 1, 2 và 3: sản phẩm PCR của gene eltA được phân lập từ ADN tổng số tách chiết từ vi khuẩn E.
coli phân lập được trong phân lợn bị tiêu chảy qua các lần 1, 2 và 3.
M 1 2 3 eltA 900 800 300 100 bp 1 2 3 ADN tổng số
Kết quả cho thấy, đoạn gene mã hóa tạo kháng nguyên độc tố LTa được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một băng ADN duy nhất, không có sản phẩm phụ với kích thước khoảng 798 bp đúng như theo tính toán lí thuyết.
Đoạn gene thu được sẽ tiếp tục thực hiện quy trình dòng hóa vào E. coli TOP10.
3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GENE eltA VÀO VECTOR PGEM®-T EASY VÀ BIẾN NẠP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ E. COLI TOP10 VÀ BIẾN NẠP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ E. COLI TOP10
Sản phẩm PCR được tinh sạch và gắn vào vector pGEM®-T easy theo phương pháp TA dưới xúc tác của enzyme ligase T4 ở 40 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C. Sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli TOP10.
Để kiểm tra sản phẩm gắn có thành công hay không, chúng tôi sử dụng 100 μl sản phẩm nuôi cấy sau khi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli TOP10 dàn đều trên đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin, chất cảm ứng IPTG và cơ chất X-gal ở 370C. Kết quả sau 14 – 16 giờ cho thấy xuất hiện các khuẩn lạc xanh/trắng. Những khuẩn lạc màu trắng thường là những khuẩn lạc có khả năng mang gene eltA. Sở dĩ như vậy là do trên vector tách dòng pGEM®-T easy, ở vùng tạo dòng có chứa trình tự gene lacZ, mã hóa tạo enzyme β-galactosidase tham gia thủy phân cơ chất X-gal tạo thành màu xanh. Do đó, những vector tách dòng đã được gắn đoạn gene ngoại lai vào thì sẽ làm thay đổi cấu trúc và làm bất hoạt gene lacZ tạo enzyme β-galactosidase. Do vậy, những vi khuẩn không chứa plasmid tái tổ hợp (chỉ chứa plasmid pGEM®-T easy tự đóng vòng) sẽ có gene lacZ hoàn chỉnh, nên trong môi trường có chất cảm ứng IPTG thì enzyme β-galactosidase sẽ được tổng hợp mạnh. Enzyme này sẽ phân huỷ cơ chất X-gal thành dẫn xuất indol, một dẫn xuất khi ở ngoài môi trường sẽ bị oxi-hoá cho màu xanh. Vì vậy, các khuẩn lạc xanh là những vi khuẩn không mang vector tái tổ hợp. Nếu sản phẩm PCR gắn được vào vector tách dòng thì nó sẽ gắn xen vào vị trí giữa gene lacZ và làm bất hoạt gene này. Do đó, enzyme β-galactosidase sẽ không được tạo ra, X-gal trong môi trường sẽ không bị phân huỷ và sẽ không tạo nên dẫn xuất indol. Khuẩn lạc hình thành sẽ có màu trắng.
Hình 3.3. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc. A: vector pGEM®-T easy. B: tế bào E. coli TOP10 sống trên môi trường chọn lọc
AAA A AAA pGEM®-T easy (3015 bp) A B
Kết quả hình 3.3 cho thấy số lượng khuẩn lạc trắng - xanh xuất hiện nhiều với tỷ lệ tương đương nhau. Kết quả này cho thấy rằng quá trình gắn vào vector và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10 đã thành công. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gene mong muốn. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn nhẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng từ đĩa nuôi cấy, tiến hành tách chiết plasmid tái tổ hợp. Đồng thời kiểm tra sự có mặt của gene mục tiêu từ khuôn mẫu ADN plasmid đó bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA và cặp mồi M13 có ở trên vector.
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ các dòng dương tính và kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA từ khuôn mẫu ADN plasmid tái tổ hợp thu được trên gel agarose 1%. Giếng M1: khối lượng thang chuẩn ADN (500 – 10000 bp, BioBase);
giếng M2: khối lượng thang chuẩn ADN (100 – 1000 bp, BioBase); giếng 1 và 2: plasmid được tách chiết từ hai dòng dương tính 1 và 2; giếng 3 và 4: PCR của gene
eltA tương ứng với plasmid 1và 2.sản phẩm
Kết quả tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene mục tiêu bằng cặp mồi đặc hiệu thể hiện trên hình ảnh điện di agarose 1% (hình 3.4). ADN plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi tách chiết chỉ có một băng. Kết quả PCR từ khuôn mẫu ADN plasmid được tách chiết với cặp mồi đặc hiệu của gene eltA cũng xuất hiện một băng vào khoảng kích thước gần 798 bp, tương đương với kích thước gene khi phân lập từ khuôn mẫu ADN genome (khoảng 798 bp). Kết quả PCR với cặp mồi M13 được trình bày ở hình 3.5. Cặp mồi M13F/M13R nằm hai đầu của vùng tạo dòng của vector pGEM®-T easy cho phép xác định đoạn gene eltA có được chèn vào vector hay không. Cặp mồi có trình tự như sau: M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC - 3’ và M13R: 5’ – AACAGCTATGACCATG - 3’. M1 1 2 M2 3 4 eltA pGEM+eltA 3000 500 1000 2000 5000 bp
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên gel agarose 1%. Giếng M: khối lượng thang chuẩn ADN (100 – 1000 bp, BioBase); giếng 1, và 2: sản phẩm PCR (bao gồm kích thước của gene eltA + kích thước do cặp mồi M13 khuếch
đại trên vector pGEM khoảng 200 bp) từ hai plasmid được tách ra từ hai dòng dương tính khác nhau.
Qua hình 3.5 cho thấy kết quả xuất hiện băng đúng với kích thước dự đoán khoảng 960 bp (bao gồm kích thước của gene eltA và một đoạn khoảng 200 bp nằm trên vector pGEM®-T Easy do cặp primer M13 khuếch đại). Như vậy, có thể kết luận rằng gene eltA đã được gắn vào vector và biến nạp thành vào tế bào vật chủ E. coli TOP10.
3.4. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE eltA
Trong quá trình tiến hành PCR, sai sót có thể xảy ra trong sản phẩm PCR, đặc biệt là sự biến đổi nucleotid trong thành phần gene eltA. Mặc dù những sai sót này có thể nhỏ nhưng lại có ảnh hưởng lớn đến kết quả biểu hiện gene. Sự thay thế nucleotid không mong muốn có thể tạo ra một trình tự mã kết thúc. Sự mất hay thêm nucleotid dẫn đến sai cấu trúc dịch mã tạo ra protein không chính xác. Chính vì vậy, để kiểm tra gene eltA đã được tách dòng chính xác là gene mong muốn, chúng tôi tiến hành giải trình tự gene eltA trong vector pGEM®-T easy. Đoạn gene eltA của vi khuẩn E. coli
nghiên cứu đã được xác định trình tự. Sau khi có trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương đồng của gene eltA ở vi khuẩn E. coli nghiên cứu với kết quả đã công bố trên ngân hàng gene thế giới (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả đọc và so sánh trình tự được trình bày ở hình 3.6. M 1 2 3 2000 300 100 900 eltA +M13 bp
Hình 3.6. Mức độ tương đồng giữa gene eltA do nhóm đề tài phân lập với gene eltA đã được công bố (K01995.1 )
Kết quả giải trình tự gene eltA trong vector tách dòng pGEM®-T easy cho thấy, gene eltA chứa khoảng 798 nucleotid và tương đồng 99,6% với gene eltA mã số K01995.1, trên ngân hàng gene quốc tế. Như vậy, các dòng tế bào E. coli TOP10 đã mang plasmid tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho kháng nguyên LTa.
Để khẳng định một cách chính xác, đoạn gene gắn trong vector tái tổ hợp này được tiến hành xác định trình tự và dịch mã sang protein, sau đó so sánh với trình tự chuẩn đã được công bố trên ngân hàng gene quốc tế mã số AEE59980.1.
Hình 3.7. Mức độ tương đồng của trình tự amino acid của kháng nguyên LTa do nhóm đề tài phân lập và kháng nguyên LTa đã được công bố (AEE59980.1)
Kết quả cho thấy: gene eltA phân lập được có trình tự amino acid suy diễn tương đồng cao so với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene quốc tế mã số AEE59980.1. Trình tự amino acid suy diễn kháng nguyên LTa phân lập được trùng khớp 100% với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene mã số AEE59980.1. Như vậy, dù có sai khác 3 nucleotid so với trình tự nucleotid của gene eltA đã công bố trên ngân hàng gene nhưng không làm thay đổi cấu trúc protein của kháng nguyên LTa.
3.5. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GENE eltA MÃ HÓA TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLI BL21 (DE3)
Sau khi PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA, sản phẩm điện di được cắt ra từ gel và tinh sạch, ADN tinh sạch được gắn vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO. Sau khi cấu trúc thành công vector tái tổ hợp pET-eltA, chúng tôi biến nạp vector pET-
eltA vào tế bào E. coli BL21(DE3) và trải trên môi trường LB có bổ sung kanamycin. Những khuẩn lạc mọc được trên môi trường sàng lọc là những tế bào đã biểu hiện thành công chủng E. coli BL21(DE3).
Hình 3.8. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc LB đặc + kanamycin 100 µg/ml. A: vector biểu hiện pET200/D-TOPO. B: tế bào E. coli BL21 (DE3)
sống trên môi trường chọn lọc
Chủng E. coli BL21 mang plasmid pET200/D-TOPO/eltA sau khi được kiểm tra khả năng biểu hiện được tiếp tục nuôi cấy trong 50 ml môi trường LB + Kanamycin ở 370C, lắc 200 vòng/phút qua đêm. Sau đó tiến hành tách chiết protein nội bào. Do đoạn gene eltA được thiết kế chèn vào vị trí định hướng đã được thiết kế trên vector pET200D/TOPO, do đó protein tái tổ hợp được biểu hiện sẽ là protein LTa dung hợp với trình tự His-tag. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này đề tài sử dụng cột sắc kí ái lực Ni-NTA để tinh sạch protein dung hợp tái tổ hợp 6xHix-LTa. Dịch chiết tế bào tổng số được đưa lên cột sắc kí, sau đó được rửa bằng đệm Tris có chứa imidazol 30 mm. Do protein tái tổ hợp LTa dung hợp với 6xHis từ plasmid pET200D/TOPO nên dễ dàng được tinh sạch nhờ ái lực cao giữa Nikel với 6xHis. Nó không bị rửa trôi trong quá trình tinh sạch. Các protein khác không gắn được với Nikel sẽ được rửa trôi. Sau khi được tinh sạch protein tái tổ hợp được kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide 15% (hình 3.9). B A eltA pET200/D-TOPO (5741 bp)
Hình 3.9. Ảnh điện di thăm dò khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ trên gel SDS – PAGE 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). 1-5: E. coli BL21 tái tổ hợp
cảm ứng với 1 mM IPTG qua các lần khác nhau. 6-8: kháng nguyên tái tổ hợp LTa sau khi ly giải ra khỏi cột sắc ký.
Kết quả điện di cho thấy đã thu được băng protein có khối lượng khoảng 30 kDa (bao gồm khối lượng của protein do gene eltA mã hóa tạo thành (25-27 kDa) + khối lượng của đuôi dung hợp 6xHis 3,7 kDa) cả mẫu trước khi cho qua cột và mẫu sau khi ly giải khỏi cột (Hình 3.9). Kết quả này cho thấy rằng protein tái tổ hợp LTa dung hợp với 6xHis đã được biểu hiện thành công, có kích thước đúng như tính toán lý thuyết và có độ sạch tương đối tốt. Sản phẩm thu được sau khi tinh sạch có thể sử dụng để làm vắc xin hoặc tạo kháng thể đơn dòng.
3.6. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
E. COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP
Khả năng sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù được đánh giá thông chỉ số sinh trưởng của tế bào.
Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa
M 1 2 3 4 5 6 7 8 LTA 35 25 15 kDa 45 55
Đường cong sinh trưởng của tế bào được trình bày ở hình 3.10 cho thấy pha lag kéo dài khoảng 2 giờ, pha sinh trưởng kéo dài từ 2-14 giờ, pha cân bằng duy trì từ