2) Ý nghĩa thực tiễn:
3.3.KẾT QUẢ TẠO DÒNG GENE eltA VÀO VECTOR PGEM®-T EASY VÀ BIẾN
VÀ BIẾN NẠP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ E. COLI TOP10
Sản phẩm PCR được tinh sạch và gắn vào vector pGEM®-T easy theo phương pháp TA dưới xúc tác của enzyme ligase T4 ở 40
C. Sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli TOP10.
Để kiểm tra sản phẩm gắn có thành công hay không, chúng tôi sử dụng 100 μl sản phẩm nuôi cấy sau khi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli TOP10 dàn đều trên đĩa thạch LB có bổ sung kháng sinh Ampicilin, chất cảm ứng IPTG và cơ chất X-gal ở 370C. Kết quả sau 14 – 16 giờ cho thấy xuất hiện các khuẩn lạc xanh/trắng. Những khuẩn lạc màu trắng thường là những khuẩn lạc có khả năng mang gene eltA. Sở dĩ như vậy là do trên vector tách dòng pGEM®-T easy, ở vùng tạo dòng có chứa trình tự gene lacZ, mã hóa tạo enzyme β-galactosidase tham gia thủy phân cơ chất X-gal tạo thành màu xanh. Do đó, những vector tách dòng đã được gắn đoạn gene ngoại lai vào thì sẽ làm thay đổi cấu trúc và làm bất hoạt gene lacZ tạo enzyme β-galactosidase. Do vậy, những vi khuẩn không chứa plasmid tái tổ hợp (chỉ chứa plasmid pGEM®-T easy tự đóng vòng) sẽ có gene lacZ hoàn chỉnh, nên trong môi trường có chất cảm ứng IPTG thì enzyme β-galactosidase sẽ được tổng hợp mạnh. Enzyme này sẽ phân huỷ cơ chất X-gal thành dẫn xuất indol, một dẫn xuất khi ở ngoài môi trường sẽ bị oxi-hoá cho màu xanh. Vì vậy, các khuẩn lạc xanh là những vi khuẩn không mang vector tái tổ hợp. Nếu sản phẩm PCR gắn được vào vector tách dòng thì nó sẽ gắn xen vào vị trí giữa gene lacZ và làm bất hoạt gene này. Do đó, enzyme β-galactosidase sẽ không được tạo ra, X-gal trong môi trường sẽ không bị phân huỷ và sẽ không tạo nên dẫn xuất indol. Khuẩn lạc hình thành sẽ có màu trắng.
Hình 3.3. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc. A: vector pGEM®-T easy. B: tế bào E. coli TOP10 sống trên môi trường chọn lọc
AAA A AAA pGEM®-T easy (3015 bp) A B
Kết quả hình 3.3 cho thấy số lượng khuẩn lạc trắng - xanh xuất hiện nhiều với tỷ lệ tương đương nhau. Kết quả này cho thấy rằng quá trình gắn vào vector và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10 đã thành công. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gene mong muốn. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn nhẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng từ đĩa nuôi cấy, tiến hành tách chiết plasmid tái tổ hợp. Đồng thời kiểm tra sự có mặt của gene mục tiêu từ khuôn mẫu ADN plasmid đó bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA và cặp mồi M13 có ở trên vector.
Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ các dòng dương tính và kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA từ khuôn mẫu ADN plasmid tái tổ hợp thu được trên gel agarose 1%. Giếng M1: khối lượng thang chuẩn ADN (500 – 10000 bp, BioBase);
giếng M2: khối lượng thang chuẩn ADN (100 – 1000 bp, BioBase); giếng 1 và 2: plasmid được tách chiết từ hai dòng dương tính 1 và 2; giếng 3 và 4: PCR của gene
eltA tương ứng với plasmid 1và 2.sản phẩm
Kết quả tách chiết plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene mục tiêu bằng cặp mồi đặc hiệu thể hiện trên hình ảnh điện di agarose 1% (hình 3.4). ADN plasmid của các dòng khuẩn lạc trắng sau khi tách chiết chỉ có một băng. Kết quả PCR từ khuôn mẫu ADN plasmid được tách chiết với cặp mồi đặc hiệu của gene eltA cũng xuất hiện một băng vào khoảng kích thước gần 798 bp, tương đương với kích thước gene khi phân lập từ khuôn mẫu ADN genome (khoảng 798 bp). Kết quả PCR với cặp mồi M13 được trình bày ở hình 3.5. Cặp mồi M13F/M13R nằm hai đầu của vùng tạo dòng của vector pGEM®-T easy cho phép xác định đoạn gene eltA có được chèn vào vector hay không. Cặp mồi có trình tự như sau: M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC - 3’ và M13R: 5’ – AACAGCTATGACCATG - 3’. M1 1 2 M2 3 4 eltA pGEM+eltA 3000 500 1000 2000 5000 bp
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên gel agarose 1%. Giếng M: khối lượng thang chuẩn ADN (100 – 1000 bp, BioBase); giếng 1, và 2: sản phẩm PCR (bao gồm kích thước của gene eltA + kích thước do cặp mồi M13 khuếch
đại trên vector pGEM khoảng 200 bp) từ hai plasmid được tách ra từ hai dòng dương tính khác nhau.
Qua hình 3.5 cho thấy kết quả xuất hiện băng đúng với kích thước dự đoán khoảng 960 bp (bao gồm kích thước của gene eltA và một đoạn khoảng 200 bp nằm trên vector pGEM®-T Easy do cặp primer M13 khuếch đại). Như vậy, có thể kết luận rằng gene eltA đã được gắn vào vector và biến nạp thành vào tế bào vật chủ E. coli TOP10.