2) Ý nghĩa thực tiễn:
1.4.CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GENE TÁ
GENE TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VẬT CHỦ
- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường phải được thiết lập và theo dõi kỹ lưỡng vì chúng có vai trò quan trọng trong quá trình biến dưỡng để tạo sinh khối tế bào và sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Để nuôi cấy tế bào đạt mật độ cao, cần phải thiết kế một môi trường có sự cân đối về các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho tế bào tăng trưởng và tránh được các tác nhân gây ức chế tế bào. Một trong những cách để đạt được tế bào E. coli
mật độ cao là tối ưu hóa môi trường tăng trưởng dùng để nuôi cấy trong giai đoạn đầu.
- Ảnh hưởng của mật độ tế bào trước khi cảm ứng (thời điểm cảm ứng)
Thời điểm cảm ứng có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng lên sản lượng protein tái tổ hợp của cả quá trình. Mỗi một loại protein tái tổ hợp khác nhau, sự cảm ứng sẽ được thực hiện ở các thời điểm khác nhau. Theo Kim và cs (2009), enzyme glutathione reductase của Brassica rapa subsp. pekinensis được sản xuất mạnh khi mật độ tế bào đạt OD600 = 0,6. Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện Proinsulin người tái tổ hợp ở hệ E. coli BL21 với vector pET – 28a(+), Trần Hồng Vân và cs (2008) đưa ra kết luận mật độ tế bào ban đầu OD600=0,6-1 là tốt nhất.
- Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng
Nồng độ chất IPTG cảm ứng cũng là yếu tố ảnh hưởng khả năng biểu hiện của gene tái tổ hợp trong tế bào vật chủ. Các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả trước đây không đưa ra một mức chung nào cho nồng độ IPTG dùng để cảm ứng. Hoàng Văn Quốc Chương (2010) cho rằng nồng độ IPTG thích hợp nhất khi sản xuất insulin tái tổ hợp là 0,3mM. Nghiên cứu của Byun (2007) kết luận nồng độ IPTG thích hợp nhất khi cảm ứng biểu hiện enzyme Guanosine 5′-diphosphate-D-mannose-4,6- dehydratase và guanosine 5′-diphosphate -4-keto-6-deoxymannose 3,5-epimerase 4- reductase là 0,1mM. Lillehoj (1998) lại khảo sát nồng độ chất cảm ứng thích hợp nhất khi biểu hiện protein interferon-gamma của người vào E. coli BL21(DE3) là 3mM.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng
Nhiệt độ cảm ứng là một thông số thiết yếu quyết định đến sự phát triển và biểu hiện protein tái tổ hợp của vi sinh vật. Hầu hết các công trình nghiên cứu đều rút ra kết luận về nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của E. coli dao động từ 370C-390C. Tuy nhiên, nhiều tác giả cũng đã chứng minh được việc giảm nhiệt độ cảm ứng từ 370C xuống còn 200C-300C giúp tăng cường sự tổng hợp và cuộn xoắn của các protein chức năng, tăng tính ổn định của các protein tái tổ hợp, cải thiện hoạt tính cũng như độ tinh khiết của các protein ngoại bào (Lee và cs, 2000). Một số tác giả khác lại cho rằng cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp ở nhiệt độ cao cho kết quả tốt hơn so với nhiệt độ thấp. Li và cs (2007) khi tiến hành thăm dò nhiệt độ biểu hiện chitinase của B. cereus
Nghiên cứu của Yingping và cs (2006) cho thấy khi cảm ứng ở nhiệt độ đầu tiên là 420C, hàm lượng protein tái tổ hợp apoliprotein ApoA-IMILANO đạt khoảng 10%, sau đó giảm còn 2% ở 370C và cuối cùng tăng đến 28,13% (tương đương 4,8 g/l) ở lần cảm ứng có nhiệt độ là 420C.
- Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
Xác định đúng thời gian để cảm ứng biểu hiện gene là vô cùng cần thiết trong sản xuất protein tái tổ hợp. Khi tối ưu các điều kiện trong nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp, Hoàng Văn Quốc Chương (2010) chỉ ra rằng, ở 16 giờ lượng protein dung hợp 6xHis-MPI thu được là 9,3%. Khi tăng thời lượng cảm ứng từ 20 giờ đến 28 giờ thì mức độ biểu hiện cũng tăng và dao động từ 10,4-11,2%. Do vậy, thời gian cảm ứng biểu hiện tốt nhất là 20 giờ. Theo Trần Hồng Vân và cs (2008), thời gian biểu hiện tính từ 2 giờ cho đến 20 giờ hàm lượng protein dịch toàn phần tăng dần, nhưng lượng protein trong dịch hòa tan chỉ tăng đến thời điểm 8 giờ thì không tăng nữa mặc dù tế bào vẫn tăng sinh. Do vậy, thời điểm 8 giờ biểu hiện được xem là thời điểm thu hoạch tế bào cho biểu hiện proinsulin có độ hoà tan cao nhất. Chung cho cả thí nghiệm thì 20 giờ là khoảng thời gian tốt nhất để thu hoạch proinsulin. Nghiên cứu của Đinh Thị Bích Lân và cs (2016) cho thấy thời gian cảm ứng 10 giờ cho sự biểu hiện protein 3-1E tái tổ hợp là cao nhất. Căn cứ vào chu trình sống của tế bào, hơn nữa nhu cầu dinh dưỡng trong môi trường chỉ có hạn nên việc xác định thời gian thích hợp nhất để thu hoạch tế bào là cần thiết.
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU