2) Ý nghĩa thực tiễn:
3.4.KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE eltA
Trong quá trình tiến hành PCR, sai sót có thể xảy ra trong sản phẩm PCR, đặc biệt là sự biến đổi nucleotid trong thành phần gene eltA. Mặc dù những sai sót này có thể nhỏ nhưng lại có ảnh hưởng lớn đến kết quả biểu hiện gene. Sự thay thế nucleotid không mong muốn có thể tạo ra một trình tự mã kết thúc. Sự mất hay thêm nucleotid dẫn đến sai cấu trúc dịch mã tạo ra protein không chính xác. Chính vì vậy, để kiểm tra gene eltA đã được tách dòng chính xác là gene mong muốn, chúng tôi tiến hành giải trình tự gene eltA trong vector pGEM®-T easy. Đoạn gene eltA của vi khuẩn E. coli
nghiên cứu đã được xác định trình tự. Sau khi có trình tự, chúng tôi tiến hành so sánh mức độ tương đồng của gene eltA ở vi khuẩn E. coli nghiên cứu với kết quả đã công bố trên ngân hàng gene thế giới (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Kết quả đọc và so sánh trình tự được trình bày ở hình 3.6. M 1 2 3 2000 300 100 900 eltA +M13 bp
Hình 3.6. Mức độ tương đồng giữa gene eltA do nhóm đề tài phân lập với gene eltA đã được công bố (K01995.1 )
Kết quả giải trình tự gene eltA trong vector tách dòng pGEM®-T easy cho thấy, gene eltA chứa khoảng 798 nucleotid và tương đồng 99,6% với gene eltA mã số K01995.1, trên ngân hàng gene quốc tế. Như vậy, các dòng tế bào E. coli TOP10 đã mang plasmid tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho kháng nguyên LTa.
Để khẳng định một cách chính xác, đoạn gene gắn trong vector tái tổ hợp này được tiến hành xác định trình tự và dịch mã sang protein, sau đó so sánh với trình tự chuẩn đã được công bố trên ngân hàng gene quốc tế mã số AEE59980.1.
Hình 3.7. Mức độ tương đồng của trình tự amino acid của kháng nguyên LTa do nhóm đề tài phân lập và kháng nguyên LTa đã được công bố (AEE59980.1)
Kết quả cho thấy: gene eltA phân lập được có trình tự amino acid suy diễn tương đồng cao so với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene quốc tế mã số AEE59980.1. Trình tự amino acid suy diễn kháng nguyên LTa phân lập được trùng khớp 100% với trình tự đã được công bố trên ngân hàng gene mã số AEE59980.1. Như vậy, dù có sai khác 3 nucleotid so với trình tự nucleotid của gene eltA đã công bố trên ngân hàng gene nhưng không làm thay đổi cấu trúc protein của kháng nguyên LTa.
3.5. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GENE eltA MÃ HÓA TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLI BL21 (DE3)
Sau khi PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA, sản phẩm điện di được cắt ra từ gel và tinh sạch, ADN tinh sạch được gắn vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO. Sau khi cấu trúc thành công vector tái tổ hợp pET-eltA, chúng tôi biến nạp vector pET-
eltA vào tế bào E. coli BL21(DE3) và trải trên môi trường LB có bổ sung kanamycin. Những khuẩn lạc mọc được trên môi trường sàng lọc là những tế bào đã biểu hiện thành công chủng E. coli BL21(DE3).
Hình 3.8. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc LB đặc + kanamycin 100 µg/ml. A: vector biểu hiện pET200/D-TOPO. B: tế bào E. coli BL21 (DE3)
sống trên môi trường chọn lọc
Chủng E. coli BL21 mang plasmid pET200/D-TOPO/eltA sau khi được kiểm tra khả năng biểu hiện được tiếp tục nuôi cấy trong 50 ml môi trường LB + Kanamycin ở 370C, lắc 200 vòng/phút qua đêm. Sau đó tiến hành tách chiết protein nội bào. Do đoạn gene eltA được thiết kế chèn vào vị trí định hướng đã được thiết kế trên vector pET200D/TOPO, do đó protein tái tổ hợp được biểu hiện sẽ là protein LTa dung hợp với trình tự His-tag. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này đề tài sử dụng cột sắc kí ái lực Ni-NTA để tinh sạch protein dung hợp tái tổ hợp 6xHix-LTa. Dịch chiết tế bào tổng số được đưa lên cột sắc kí, sau đó được rửa bằng đệm Tris có chứa imidazol 30 mm. Do protein tái tổ hợp LTa dung hợp với 6xHis từ plasmid pET200D/TOPO nên dễ dàng được tinh sạch nhờ ái lực cao giữa Nikel với 6xHis. Nó không bị rửa trôi trong quá trình tinh sạch. Các protein khác không gắn được với Nikel sẽ được rửa trôi. Sau khi được tinh sạch protein tái tổ hợp được kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel polyacrylamide 15% (hình 3.9). B A eltA pET200/D-TOPO (5741 bp)
Hình 3.9. Ảnh điện di thăm dò khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ trên gel SDS – PAGE 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). 1-5: E. coli BL21 tái tổ hợp
cảm ứng với 1 mM IPTG qua các lần khác nhau. 6-8: kháng nguyên tái tổ hợp LTa sau khi ly giải ra khỏi cột sắc ký.
Kết quả điện di cho thấy đã thu được băng protein có khối lượng khoảng 30 kDa (bao gồm khối lượng của protein do gene eltA mã hóa tạo thành (25-27 kDa) + khối lượng của đuôi dung hợp 6xHis 3,7 kDa) cả mẫu trước khi cho qua cột và mẫu sau khi ly giải khỏi cột (Hình 3.9). Kết quả này cho thấy rằng protein tái tổ hợp LTa dung hợp với 6xHis đã được biểu hiện thành công, có kích thước đúng như tính toán lý thuyết và có độ sạch tương đối tốt. Sản phẩm thu được sau khi tinh sạch có thể sử dụng để làm vắc xin hoặc tạo kháng thể đơn dòng.