2) Ý nghĩa thực tiễn:
3.8. KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG BIỂU
BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG CHỦNG E. COLI BL21(DE3)
3.8.1. Kết quả thăm dò thời gian cảm ứng tối ưu
Thông thường, tế bào chỉ sinh trưởng đến một nồng độ nhất định rồi dừng lại. Nếu thu tế bào quá muộn, nhiều tế bào già bị chết nên hàm lượng protein tái tổ hợp trong tế bào giảm đi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thu tế bào theo các khoảng thời gian 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ, 14 giờ và 16 giờ để khảo sát xem thời gian thích hợp nhất cho cảm ứng biểu hiện là lúc nào. Sinh khối tế bào thu được, tiến hành tách chiết protein và điện di trên gel polyacrylamide 15%. Kết quả thể hiện trên hình 3.11 cho thấy protein dung hợp 6xHis-LTA bắt đầu tổng hợp sau 2 giờ cảm ứng và tăng dần đạt giá trị cao nhất sau 6 giờ. Do vậy, thời gian 6 giờ được chúng tôi sử dụng thu mẫu sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG (1 mM) trong 50 ml môi trường YJ. Khi biểu hiện protein dung hợp IFN-CSP/pET-21b trong tế bào E. coli
BL21 (DE3), Lu và cs (2015) cũng cho thấy 6 giờ là thời điểm tối ưu nhất cho sự biểu hiện này.
Hình 3.11. Ảnh điện di thăm dò thời gian cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). 2, 4, 6,
8, 10, 12, 14 và 16: là thời gian cảm ứng IPTG.
3.8.2. Kết quả thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và trạng thái biểu hiện của protein tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện. Trong đó, nồng độ chất cảm ứng có ảnh hưởng rất lớn. Vì vậy, trước khi biểu hiện lượng lớn, chúng tôi tiến hành thăm dò nồng độ chất cảm ứng thích hợp nhất. Trong nghiên cứu này sử dụng chất cảm ứng biểu hiện là IPTG.
M 2 4 6 8 10 12 14 16 giờ LTA 10 15 25 kDa 35
IPTG là chất cảm ứng đối với T7 promoter trong đó promoter này điều khiển trực tiếp quá trình sinh tổng hợp LTa. Vì thế nghiên cứu ảnh hưởng của dãy nồng độ IPTG khác nhau là điều rất cần thiết.
IPTG được khảo sát ở dải nồng độ từ 0,2 đến 2 mM. Kết quả (Hình 3.12) cho thấy, sau khi cảm ứng bằng IPTG dòng tái tổ hợp đã tổng hợp một lượng lớn protein có kích thước khoảng 30 kDa, đúng với kích thước dự đoán của gene tái tổ hợp. Hàm lượng protein được tổng hợp phụ thuộc vào nồng độ IPTG cảm ứng.
Hình 3.12. Ảnh điện di thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C. 0,2; 0,4; 0,6,
0,8; 1,0; 1,2; 1,5 và 2,0: là nồng độ chất cảm ứng IPTG.
Dựa trên ảnh điện di có thể thấy, mức độ biểu hiện của eltA thay đổi theo nồng độ chất cảm ứng IPTG, khi nuôi cấy chủng E. coli BL21(DE3)/pET200/D-TOPO có cảm ứng bằng IPTG thì đều có sự xuất hiện vạch protein có kích thước khoảng 30 kDa, được xác định là protein dung hợp 6xHis-eltA. Trường hợp không có vector tái tổ hợp (NC) thì không có sự biểu hiện protein này. Khi tăng nồng độ chất cảm ứng IPTG từ 0,2 mM lên 0,8 mM thì mức độ biểu hiện 6xHis-eltA tương ứng cũng tăng lên. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ chất cảm ứng từ 0,8 mM đến 2 mM thì mức độ biểu hiện vẫn không thay đổi. Điều kiện cảm ứng 0,8 mM được chọn làm cơ sở cho các thí nghiệm nghiên cứu về sau. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Lu và cs (2015) khi tối ưu các điều kiện biểu hiện IFN-CSP trong tế bào E. coli BL21 với vector biểu hiện là pET-21b.
3.8.3. Kết quả thăm dò thành phần các môi trường tối ưu
Thành phần môi trường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy môi trường thích hợp cho nhân giống sinh khối có thể không thích hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp. Chúng tôi đã khảo sát khả năng biểu hiện của protein dung hợp 6xHis-eltA
M NC 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,5 2 mM LTA 10 15 25 kDa
trên 5 loại môi trường với các thành phần khác nhau (LB, YJ, TB, HSG và M9ZB cải tiến). Thí nghiệm được tiến hành trong cùng một điều kiện (cảm ứng với 0,8 mM IPTG, lắc 200 vòng/phút, ở 37ºC trong thời gian 6 giờ) trên gel SDS-PAGE chỉ ra rằng môi trường YJ cho kết quả biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa tốt nhất, tiếp đến là môi trường HSG và M9ZB cải tiến, môi trường LB và TB không thích hợp cho biểu hiện sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp LTa trong quy mô phòng thí nghiệm nên cho hàm lượng kháng nguyên thấp nhất (hình 3.13). Thăm dò thành phần môi trường biểu hiện cho sản xuất protein tái tổ hợp được nhiều tác giả nghiên cứu. Chẳng hạn, Đinh Thị Bích Lân và cs (2016) cho thấy kháng nguyên 31-E biểu hiện mạnh trong môi trường LB so với các môi trường TB, YJ, SOB và SOC , Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2014) cho thấy môi trường thích hợp cho sự biểu hiện của kháng nguyên bám dính K88-1NT là M9ZB cải tiến.
Hình 3.13. Ảnh điện di thăm dò thành phần các môi trường tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC1: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C. NC2: E. coli
mang vector tái tổ hợp không bổ sung chất cảm ứng IPTG sinh trưởng ở 370C. M9ZB; HSG; LB; YJ; và TB: là các môi trường biểu hiện có chứa các thành phần khác nhau.
3.8.4. Kết quả thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu
Mật độ ban đầu là một trong những yếu tố có liên quan mật thiết đến sinh khối và thời gian đạt mật độ cực đại. Xác định mật độ ban đầu thích hợp rất có ý nghĩa trong sản xuất, giúp ta tiết kiệm được thời gian và giống. Từ những lý do trên, thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sự biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa đựợc tiến hành. Để xác định được thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các mức khác nhau của mật độ tế bào đo được lúc bắt đầu cảm ứng từ 0,2 đến 3. Kết quả thu nhận được trình bày trên hình 3.14. Qua hình ảnh chúng tôi nhận thấy rằng mật độ tế bào thích hợp trước khi bổ sung chất cảm ứng IPTG (0,8 mM) trên 50 ml môi trường YJ để thu được kháng nguyên tái tổ hợp cao nhất là OD600 = 0,8. M NC1 NC2 LB TB M9ZB YJ HSG LTA 15 25 35 kDa
Hình 3.14. Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C
. 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 và 3,0: là các mật độ tế bào khác nhau trước khi bổ sung chất cảm ứng
3.8.5. Kết quả thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu
Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát khả năng sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp ở 5 mức nhiệt độ khác nhau 160C, 200C, 250C, 300C, 370C. Kết quả thu được trên hình 3.15 cho thấy ở 160C, lượng protein biểu hiện rất ít và cao nhất ở 250C. Vì thế chúng tôi chọn nhiệt độ 250C để biểu hiện gene trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Kết quả này phù hợp với kết quả của Văn Thị Như Ngọc và cs (2007) khi biểu hiện gene HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Hamegglutinnin của virus cúm A H5N1 trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cũng đưa ra mốc nhiệt độ tối ưu cho sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp trong tế bào E. coli là 300C như Hoàng Hà và cs (2008) khi biểu hiện tiểu đơn vị p51 của enzyme phiên mã ngược của virus HIV, Tương tự, nghiên cứu của Lee và cs (2006) cũng cho thấy khi nuôi nhân giống và nuôi cảm ứng biểu hiện L-threonine trong E. coli MT201 ở quy mô phòng thí nghiệm tại 300C cho lượng L-threonine khá cao.
M NC1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 2,0 3,0 LTA 10 25 35 15
Hình 3.15. Ảnh điện di thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15%. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-170 kDa, Bio-Base). NC: E. coli không mang vector tái tổ hợp sinh trưởng ở 370C. 160C, 200C,
250C, 300C, 350C và 370C: là các nhiệt độ cảm ứng khác nhau. M NC 16ºC 20ºC 25ºC 30ºC 37ºC LTA 15 25 35 kDa
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
- Tạo dòng và xác định được trình tự của đoạn gene eltA mã hóa tiểu đơn vị A của kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LT của vi khuẩn E. coli có chiều dài 798 bp.
- Biểu hiện thành công gene mã hóa kháng nguyên độc tố LTa với vector pET200/D-TOPO trong E. coli BL21 (DE3). Với môi trường nuôi cấy YJ, tỷ lệ tiếp giống 1%, tốc độ lắc 200 vòng/phút, và nuôi cấy sau 8 giờ là các điều kiện tối ưu để thu sinh khối tế bào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp.
- Protein dung hợp 6xHis- LTacó khối lượng phân tử khoảng 30 kDa, biểu hiện mạnh nhất sau 6 giờ cảm ứng ở 250C với nồng độ IPTG 0,8 mM, môi trường nuôi cấy YJ, mật độ tế bào ban đầu OD600 = 0,8.
4.2. ĐỀ NGHỊ
- Nghiên cứu ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất vắc xin hoặc kháng thể lòng đỏ, phục vụ cho việc phòng và trị tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Hoàng Văn Quốc Chương (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, Huỳnh Văn Kháng (1996),
Bệnh ở lợn nái và lợn con, Nhà Xuất Bản Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Hoàng Hà, Phan Trọng Hoàng, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008), Biểu hiện tái tổ hợp và tinh sạch tiểu đơn vị p51 của enzyme phiên mã ngược của virus HIV-1 trong E. coli, Tạp chí công nghệ sinh học 6(1), tr. 43-48. 4. Nguyễn Xuân Hòa, Lê Văn Phước, Hồ Lê Quỳnh Châu, Lê Xuân Ánh (2010),
Xác định các gen sinh độc tố của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy, Tạp Chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, Tập 10, tr. 49-51. 5. Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Nguyễn Hoàng Lộc, Giang Thanh Nhã,
Nguyễn Quang Vinh, Trần Thúy Lan (2009), Nghiên cứu sản xuất que chẩn đoán nhanh bệnh do Toxoplasma gondii gây ra ở người và gia súc, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, (6), tr. 56-61.
6. Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Huỳnh Văn Chương, Đặng Thanh Long, Hoàng Tấn Quảng, Lê Đức Thạo, Lê Quốc Việt, Lê Công Thịnh, Trần Thị Việt Luân (2015), Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên 3-1E từ Eimeria
được phân lập tại Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XXIII, (2), tr. 55-63.
7. Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long, Huỳnh Văn Chương, Đặng Thanh Long, Hoàng Tấn Quảng, Lê Đức Thạo, Lê Quốc Việt, Lê Công Thịnh, Đặng Thị Hương, Hoàng Thị Thùy Nhung (2016), Cải thiện mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E của Eimeria trong Escherichia coli BL21, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, Tập XXII, (7), tr. 60-67.
8. Nguyễn Hoàng Lộc, Nguyễn Thị Khánh Quỳnh, Hoàng Tấn Quảng, Trần Thúy Lan, Lê Mỹ Tiểu Ngọc, Đinh Thị Bích Lân, Phùng Thăng Long (2014), Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của kháng nguyên bám dính K88 tái tổ hợp phân lập từ Escherichia coli mang độc tố đường ruột của lợn con cai sữa, Tạp chí sinh học, 36 (1se), tr. 120-125.
9. Văn Thị Như Ngọc, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Thanh Nhàn, Nguyễn Phước Hải, Trương Văn Dung, Trương Nam Hải (2007), Biểu hiện gen HA5-1 mã hóa tiểu phần kháng nguyên Haemaglutinin (HA) của virus cúm A H5N1 trong
Escherichia coli, Tạp chí công nghệ sinh học, Tập 5, (3), tr. 313-320.
10. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Đỗ Ngọc Thúy, Âu Xuân Tuấn, Nguyễn Xuân Huyên, Văn Thị Hường, Đào Thị Hảo (2004), Lựa chọn chủng E. coli để chế tạo Autovacxin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con theo mẹ. Viện Thú Y 35 năm xây dựng và phát triển (1969 -2004). NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 110-111.
11. Trương Quang (2005), Kết quả nghiên cứu vai trò gây bệnh của E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn 1-60 ngày tuổi, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tập XII, tr. 27-32.
12. Trần Thị Quế (2011), Thiết kế và biểu hiện protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC và sản xuất kháng thể đa dòng kháng LT trên quy mô phũng thí nghiệm, Luận văn thạc sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
13. Hồ Soái, Đinh Thị Bích Lân (2005), Xác định nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tiêu chảy ở lợn con tại xí nghiệp lợn giống Triệu Hải-Quảng Trị và thử nghiệm phác đồ điều trị, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, tr. 26-34.
14. Bạch Thị Như Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Lê Phương Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), Biểu hiện protein GP41 của virus HIV phân type CRF01_AE trong E. coli và ứng dụng để phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot và Elisa, Tạp chí Công nghệ sinh học, 9 (1), tr. 29-36.
15. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh vật thú y. NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 81 – 85.
16. Nguyễn Thị Hoài Thu (2014), Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố SEB, Luận văn thạc sỹ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam-Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật.
17. Nguyễn Thị Thanh Thủy (2012), Nghiên cứu một số đặc tính của vi khuẩn
Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bò, lợn được giết mổ tại Hà Nội, Luận án tiến sĩ nông nghiệp Hà Nội.
18. Nguyễn Thị Trung, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Văn Cường, Trương Văn Dung, Jan- Christer Janson, Trương Nam Hải (2006), Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Roi tái tổ hợp đặc hiệu cho Salmonella Typhimurium, Tạp chí công nghệ sinh học, 4 (3), tr. 309-318.
19. Bùi Trung Trực, Nguyễn Việt Nga, Thái Quốc Hiếu, Lê Thanh Hiếu, Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân (2004), Phân lập và định typ kháng nguyên vi khuẩn
E. coli trong phân lợn nái, lợn con tại tỉnh Tiền Giang, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, (1), tr. 12-19.
20. Trần Hồng Vân, Nguyễn Trọng Tuệ, Lê Văn Phủng (2008), Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu trong biểu hiện proinsulin người tái tổ hợp ở hệ E. coli BL21 (DE3) với vector pET – 28a(+), Tạp chí nghiên cứu y học 53 (1).
21. Phạm Thị Thanh Yến (2008), Áp dụng phương pháp Elisa phát hiện độc tố LT của các chủng Escherichia coli phân lập trong thực phẩm. Tạp chí DD&TP/Journal of Food and Nutrition Sciences - Tập 4, (2).
Tài liệu tiếng Anh
22. Blanco J.E, M. Blanco A. Mora and J. Blanco. (1997), Production of toxins (enterotoxins, verotoxins and necrotoxins) and colicins byEscherichia coli strains isolated from septicemic and healthy chickens: Relationship with in vivo pathogenicity, J. Clin. Microbiol, (35), pp. 2953-2957.
23. Bloch K. (2006), Infectious Diarrhea, Chapter 4 Infectious Diseases, Pathophysiology of Disease, Lange, 5th edition, McGraw-Hill Medical, United States of America, pp. 80-83.
24. Byun S. G., Kim M. D., Lee W. H., Lee K.J., Han N. S., Seo J. H. (2007), Production of GDP-L-fucose, L-fucose donor for fucosyloligosaccharide synthesis in recombinant Escherichia coli, Applied Microbiology and Biotechnology, (74), pp. 768-775.
25. Cheng E, Cardenas-Freytag L. and Clements J.D. (1999), The role of cAMP in