2) Ý nghĩa thực tiễn:
1.3.3.Hệ thống vector tạo dòng pGEM®-T easy
Có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại trong tế bào vật chủ trong nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gene của tế bào vật chủ. Vector này mang đầy đủ những đặc điểm của một vector tách dòng:
Đầu lồi thymidine 3’ cho phép dễ dàng PCR cloning: Các vector pGEM®-T easy được thiết kế với một đầu lồi 3’- thymidine. T-nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi các enzyme tổng hợp.
Lựa chọn các thể chuyển nạp xanh / trắng: Vector pGEM®-T easy là vector có số lượng bản copy cao, chứa các promoter T7 và RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR (multiple cloning region), bên trong có chứa đoạn mã cho α-peptidee và enzyme β-galactosidase. Khi gene mục tiêu được chèn vào vector làm bất hoạt enzyme β- galactosidase, đây là cơ sở cho việc lựa chọn khuẩn lạc xanh trắng.
Có nhiều vị trí cắt cho enzyme giới hạn: Vector pGEM®-T easy chứa một số lượng lớn vị trí cắt của các enzyme giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR. Vùng MCR của vector pGEM®-T easy gồm các vị trí nhận biết của enzyme EcoRI, BstZI và NotI, cho phép 3 enzyme có thể cắt các đoạn chèn vào một cách độc lập.
Gắn nhanh chóng: vector pGEM®-T easy được cung cấp với đệm 2x rapid ligation buffer. Phản ứng gắn thường được ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng (tốt nhất là để qua đêm).
Các trình tự và vị trí nhân dòng của vector PGEM®-T easy. Vector pGEM®- T easy có thể được làm thẳng ở vị trí base thứ 60 bằng enzyme EcoRV và thêm một base T vào đầu 3’. Vị trí cắt của EcoRV sẽ được khôi phục lại bằng phản ứng gắn của vector và đoạn cài.
Bảng 1.2. Thành phần chính của plasmid pGEM®-T easy
Thành phần Vị trí
Điểm khởi đầu phiên mã T7 RNA polymerase 1
Trình tự đa cắt nối 10 – 128
SP6 RNA polymeraza promoter (-17 đến 3) 139 – 158 Điểm khởi đầu phiên mã SP6 RNA polymerase 141 Vị trí bám mồi pUC / M13 ngược 176 – 197
Bộ ba mở đầu gene lacZ 180
Lac operator 200 – 216
Vùng mã hóa β-lactamase 1337 – 2197
Gene kháng ampicillin 1338 – 2198
F1 ori 2513 – 2819
Vùng mã hóa lac operon 2836 – 2996, 166 – 395 Vị trí bám mồi pUC / M13 xuôi 2941 – 2957
T7 RNA polymeraza promoter 2984 – 3