2) Ý nghĩa thực tiễn:
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn E. coli mang gene eltA gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Miễn dịch học và Vắc-xin, Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
- Thời gian thực hiện: Tháng 08/2015 đến 04/2016.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
+ Nghiên cứu phân lập gene eltA bằng phản ứng PCR
+ Nghiên cứu tạo dòng gene eltA vào vector tạo dòng và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10
+ Nghiên cứu tạo dòng vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli BL21 (DE3)
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh trưởng của chủng
E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp. -Môi trường sinh trưởng -Tỷ lệ tiếp giống
-Tốc độ lắc
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa trong chủng E. coli BL21(DE3).
-Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
-Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG -Ảnh hưởng của môi trường cảm ứng
-Ảnh hưởng của mật độ tế bào trước khi cảm ứng. -Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thu thập mẫu phân lợn tiêu chảy 2.3.1. Thu thập mẫu phân lợn tiêu chảy
Mẫu phân của lợn tiêu chảy nghi do nhiễm vi khuẩn E. coli được chúng tôi thu thập ở một số trang trại trên địa bàn Thừa Thiên Huế.
Lấy mẫu: Mẫu phân được lấy từ lợn có triệu chứng tiêu chảy và chưa điều trị bằng bất cứ loại thuốc kháng sinh nào. Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu một vòng vào trong lỗ hậu môn sau đó lấy tăm bông ra và cho vào ống túi nilon có ghi số hiệu. Tính chuyên biệt và các thông tin khác được ghi trong sổ số liệu thô.
Bảo quản mẫu: Mẫu phân được bảo quản lạnh trong bình đựng mẫu đưa về phòng thí nghiệm và có thể kiểm tra ngay trong ngày. Tất cả các mẫu phân đều được xét nghiệm tại phòng Miễn dịch học và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học-Đại học Huế.
2.3.2. Tách chiết ADN tổng số
ADN tổng số của vi khuẩn E. coli được tách theo kít QIAamp® ADN Stool Mini kit (50) (Qiagen).
Việc thu nhận ADN từ tế bào vi khuẩn được tiến hành thông qua nhiều bước. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết ADN bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân, (2) Loại protein, (3) Tủa ADN.
Các bước thực hiện:
1. Cho tăm bông vào trong ống falcon 15ml có chứa 5ml môi trường LB, nuôi qua đêm ở 370
C, lắc 200 vòng/phút.
2. Chuẩn bị một ống eppendorf có chứa 15 µl protein K
3. Cho 200 µl dịch nuôi cấy vào trong tuýp 1.5 ml ở bước 2. Trộn đều bằng Vortex trong 15 giây.
4. Thêm 200 µl đệm AL và vortex trong 15 giây, sau đó ủ ở 560C trong 10 phút 5. Tiếp tục bổ sung 200 µl ethanol (96-100%) vào ống eppendorf và đảo nhẹ. 6. Chuyển toàn bộ dung dịch từ bước 5 sang cột QIAamp, đậy nắp và ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút. Chuyển cột lọc sang một ống eppendorf mới.
7. Rửa cột với 500 µl đệm AW1, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút. Chuyển cột lọc sang một ống eppendorf mới
8. Rửa cột với 500 µl đệm AW2, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 3 phút, loại bỏ ống thu chứa dịch lọc ở phía dưới.
9. Chuyển cột lọc qua một ống eppendorf mới, bổ sung 200 µl đệm TE trực tiếp lên màng của cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút để tách rửa (elute) ADN, bảo quản ADN ở -200C.
2.3.3. Phân lập gene eltA bằng phản ứng PCR
Thiết kế mồi đặc hiệu cho gene eltA
Vùng gene mã hóa tổng hợp tạo kháng nguyên độc tố LTa của E. coli được chọn làm vùng đích để thiết kế cặp mồi thu nhận gene eltA. Sau khi xác định được vùng gene chỉ thị eltA, chúng tôi tiến hành thiết kế các cặp mồi (primer) đặc hiệu bằng phần mềm Plusprimer3, trình tự nucleotid được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotid của cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA
Tên mồi Trình tự nucleotid (Nu)
LTAFB 5’-CACCATGATATATAAGTTTTCCTCGATG-3’ LTARC 5’-TCATAATTCATCCCGAATTCTG-3’ Phản ứng PCR
Phản ứng PCR dùng để phân lập gene eltA của vi khuẩn E. coli được tiến hành theo phương pháp PCR chuẩn của Sambrook và cs (1989) (Sambrook và cs, 1989). Thành phần phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR phân lập gene eltA của E. coli
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
GoTag Green Master Mix, 2 X 12,5
Mồi xuôi (10 pmol/ µl) 1
Mồi ngược (10 pmol/ µl) 1
ADN khuôn mẫu (50 ng/µl) 1
Nước tinh khiết 9,5
Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Chất lượng ADN sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X (40 mM Tris-acetate, 1 mM ) ở 100 V trong 35 phút.
550C 720C 720C 40C 1 phút 10 phút 35 chu kỳ 1 phút – ∞ 940C 940C 5 phút 1 phút
Gel sau khi điện di được nhuộm bằng Ethidium bromide nồng độ 0,5 μg/ml trong thời gian 15 - 30 phút trên máy lắc nhẹ. Gel được quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại μ = 302 nm bằng hệ thống DyNA Light, Dual Intensity UV Transillumninator (Labnet).
Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được cắt ra từ gel agarose 1% và tinh sạch bằng KIT ISOLATE II PCR and Gel (BIOLINE)
1. Bổ sung 200 µl Binding Buffer (CB) cho mỗi 100 mg gel, ủ ở 500C trong 5-10 phút cho gel tan hoàn toàn.
2. Chuyển toàn bộ dịch hòa tan vào cột lọc Gel Column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây, loại bỏ dung dịch ở phía dưới cột lọc.
6. Bổ sung 700 µl đệm rửa CW (wash buffer CW) vào cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây, loại bỏ dung dịch ở phía dưới cột lọc.
7. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ toàn bộ ethanol có trên màng. 8. Chuyển cột lọc vào ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung 15 – 30 µl Elution buffer C, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
9. ADN tinh sạch bảo quàn -200C.
2.3.4. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gene
Tạo vector tái tổ hợp
Sản phẩm phản ứng PCR thu được sau khi tinh sạch sẽ được gắn vào vector pGEM® -T Easy Vector System theo phương pháp dòng hóa TA (TA-cloning) của hãng Invitrogen, có enzyme T4 ADN ligase làm enzyme nối.
Nguyên lý: Các nucleotid nằm ở đầu dính của một sợi ADN đơn có khả năng hình thành cầu nối hydro với các nucleotid bổ sung nằm trên đầu dính của đoạn ADN khác. Nhờ sự xúc tác của enzyme ADN ligase, cầu nối phosphodieste được hình thành giữa hai nucleotid sát cạnh nhau của hai đoạn ADN này. Kết quả là một liên kết este hình thành giữa gốc phốt phát đầu 5’ của đoạn ADN này với gốc hydroxyl đầu 3’ của đoạn kia đồng thời giải phóng ra một phân tử nước và hai sợi ADN gắn được với nhau.
Quy trình: Tùy thuộc vào nồng độ và chiều dài của các đoạn ADN cần nối mà có tỷ lệ trộn mẫu plasmid và đoạn gene mục tiêu khác nhau. Phản ứng nối ghép thường được tiến hành với tổng thể tích là 10 µl (bảng 2.3).
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
Đệm (2X) 5 µl
Vector pGEM®-T Easy (50 ng/µl) 1 µl
T4 ADN ligase (3U/µl) 1 µl Sản phẩm PCR (12 ng/µl) 1 µl Bổ sung nước cất vô trùng để đạt
thể tích cuối cùng 10 µl
Phản ứng được ủ 25ºC trong 1 giờ, sau đó ủ qua đêm ở 4ºC.
Biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli TOP10
Tiến hành
1. Rả đông tế bào khả biến E. coli TOP10 từ từ trong đá để tránh tế bào vở do sốc nhiệt 2. Bổ sung 10 µl sản phẩm gắn vào 200 µl tế bào khả biến nói trên và tiếp tục ủ trong đá 60 phút.
3. Sốc nhiệt 420C trong 60 giây, và chuyển nhanh vào đá khoảng 10 phút.
4. Bổ sung 800 µl môi trường Luna Broth (LB) lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong khoảng 1 giờ.
5. Lấy 100-200 µl dịch nuôi cấy tế bào trên dàn đều lên đĩa có chứa môi trường LB agar ampicillin (50 µg/ml), 30 µl X-gal (20 mg/ml) và 30 µl IPTG 100 mM và trên môi trường LB agar không bổ sung kháng sinh đối với mẫu đối chứng. Ủ đĩa ở 370
C qua đêm.
Sản phẩm của quá trình biến nạp được kiểm tra bằng phương pháp chọn lọc khuẩn lạc Xanh-trắng.
Phương pháp chọn lọc các dòng dương tính
Chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng mọc trên môi trường chọn lọc cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường LB có bổ sung 50 µg/ml kháng sinh ampicilin, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm. Sinh khối tế bào thu được tiến hành tách chiết ADN plasmid trên cột EZ-10 (EZ-10 Spin Column Plasmid ADN Minipreps kit, BS6141 (Bio Base INC). Sản phẩm plasmid sẽ được kiễm tra bằng điện di agarose 1% và kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen eltA và cặp mồi M13 được thiết kế sẵn trên vector pGEM® -T Easy (M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC-3´ và M13R: 5´CAGGAAACAGCTATGAC-3´).
Quy trình tách chiết Plasmid:
1. Sinh khối tế bào được thu nhận bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút. 2. Tái huyền phù sinh khối tế bào trong 100 µl Solution I, giữ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
3. Bổ sung 1 µl VisualLyse, trộn đều, ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
4. Bổ sung 200 µl Solution II và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảo lên đảo xuống 4-6 lần, sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút (Không vortex).
5. Tiếp tục bổ sung 300 µl Solution III, trộn nhẹ nhàng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.
6. Ly tâm 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút.
7. Chuyển toàn bộ dịch nổi sang cột EZ-10, ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút. 8. Loại bỏ dung dịch ở phía dưới, bổ sung 750 µl Wash solution vào cột, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút (lặp lại bước 8 một lần nữa).
9. Loại bỏ dung dịch ở phía dưới cột, làm khô màng bằng cách ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút.
10. Chuyển cột lọc sang ống effendorf mới (1,5 ml), bổ sung 50 µl Elution Buffer vào chính giữa cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút, thu dịch ở phía dưới.
11. Bảo quản ADN tinh sạch ở -200C.
2.3.5. Biểu hiện gen trong vector pET200/D-TOPO
Sản phẩm PCR từ các vector pGEM®-T Easy được cắt ra trên gel agarose 0,8% và tinh sạch bằng KIT ISOLATE II PCR and Gel (BIOLINE), sau đó gắn vào vector pET200/D-TOPO (Hình 3.8A) mang promoter T7 (Invitrogen). Thành phần phản ứng gắn bao gồm: 8 ng ADN, 20 ng vector pET200/D-TOPO, 1 µl dung dịch muối, bổ sung nước vô trùng để đạt thể tích phản ứng là 6 µl. Trộn nhẹ và ủ ở 250
C trong 60 phút. Tiếp theo, phản ứng gắn được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt ở 420
C trong 60 giây, thành phần bao gồm: 6 μl phản ứng gắn, 200 μl tế bào E. coli BL21 và 800 μl môi trường SOC (2% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm men; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; và 20 mM glucose; pH 7,0). Dung dịch biến nạp được cấy trải trên đĩa petri chứa môi trường LB đặc (1% tryptone; 0,5% dịch chiết nấm men; và 1% NaCl; 1,5% agar, pH 7,0) có bổ sung 100 μg/ml Kanamycin và ủ ở 370C qua đêm. Vector pET200/D-TOPO không có khả năng tự đóng vòng, do đó những tế bào E. coli sống được trên môi trường chọn lọc (LB + kanamycin) đều mang vector pET200/D-TOPO tái tổ hợp với sản phẩm PCR (Mierendorf, 2000).
Các tế bào E. coli có vector biểu hiện mang sản phẩm PCR là đoạn mã hóa của gen kháng nguyên độc tố được nuôi trong bình tam giác chứa 250 ml môi trường YJ lỏng 100 μg/ml Kanamycin ở 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Khi mật độ tế bào của
dịch nuôi cấy đạt tới OD600 = 1,0 thì bổ sung IPTG đến nồng độ 1 mM và nuôi tiếp ở 370C. Sinh khối tế bào được thu nhận 2 giờ một lần bằng cách ly tâm trong 1 phút, 15.000 vòng/phút. Phá vỡ tế bào E. coli trong đệm 2 ml TNE (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA) + 1% Trixton X-100 và siêu âm với tần số 40 Hz xung 10 giây trong 5 phút. Dịch protein hòa tan nội bào được thu nhận bằng cách ly tâm 15.000 vòng/phút trong 5 phút.
Biểu hiện của gen kháng nguyên nội bào được phân tích bằng điện di polyacrylamide gel 15% có SDS ở 60 V. Sau đó, gel được nhuộm với Coomassie Blue R-250 và hình ảnh được phân tích bằng phần mềm Quality One (ver 4.1, Bio-Rad).
2.3.6 Điện di SDS- PAGE
Cách tiến hành điện di SDS-PAGE 12%
Nguyên lý:SDS có tác dụng biến tính và tích điện cho phân tử protein. Độ tích điện tỷ lệ với trọng lượng phân tử của chúng. Dưới tác dụng của điện trường, các phân tử chuyển động về cực dương với tốc độ tỷ lệ nghịch với trọng lượng phân tử của chúng. Các phân tử nhỏ chuyển động nhanh, các phân tử lớn chuyển động chậm. Từ đó chúng sẽ phân bố ở các vị trí khác nhau trên bản điện di. Protein trong gel polyacrylamide được phát hiện bằng cách nhuộm với Coomasie Brilliant Blue (CBB) và quan sát bằng mắt thường.
Qui trình
Bước 1: Chuẩn bị gel polyacrylamide 15%
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất. Lau sạch các tấm kính bằng ethanol, sau đó lau lại thật sạch bằng nước cất. Gắn các tấm kính vào giá đỡ. Thử độ thấm lắp ghép bằng nước cất, nếu nýớc chảy ra từ khe ghép nhiều thì phải làm lại.
Đổ gel theo công thức:
Bảng 2.4. Công thức gel polyacrylamide 15%
Thành phần Separating gel (15%) Stacking gel (5%)
DW 1,25 ml 0,88 ml Acrylamide (30%) 2,5 ml 0,26 ml Separating 1,25 ml - Stacking - 0,38 ml TEMED 7,5 µl 2 µl APS 45 µl 12 µl
Bước 2: Cho gel vào buồng điện di, đổ ngập bằng đệm chạy (1X Electrophoresis buffer). Chú ý không để bọt khí ở phía dýới tấm kính, dùng pipette làm sạch gel thừa trong các giếng. Chạy prerun khoảng 5 phút ở 80 - 100 V cung cấp ion cho điện trường hoạt động).
Bước 3: Tra mẫu: Dùng Hamilton syringe lấy 20 µL (30 µg protein) sản phẩm protein kháng nguyên mỗi loại, trộn với 5 µl chỉ thị màu (Loading dye 5X) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong gel.
Bước 4: Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 6 µl chỉ thị phân tử (Protein marker) thường dùng ở đây là chỉ thị protein “SDS-PAGE Molecular Weight Standards,Low Rang (Bio Rad) tạo thành 7 phân đoạn có độ dài từ 6,25 – 97 kDa.
Bước 5: Nối hệ thống điện di với nguồn điện, protein kháng nguyên sẽ chuyển dịch từ cực âm đến cực dương. Chạy điện di ở hiệu thế 60 - 100 V trong 2,5 - 4,5 giờ cho đến khi vạch màu đi hết độ dài tấm kính (thời gian thay đổi tùy theo mẫu).
Bước 6: Lấy gel ra khỏi buồng điện di, cho vào dụng cụ nhuộm (thường là các hộp nhựa) có chứa dung dịch gel staining, lắc nhẹ khoảng 25 vòng/phút trong khoảng từ 10 - 15 phút và sau đó rửa gel bằng dung dịch gel destaining trên máy lắc nhẹ, khoảng 10 phút thay dung dịch rửa 1 lần cho đến khi hoàn thành và chụp ảnh giữ mẫu kiểm tra.
2.3.7. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp tổ hợp
Chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được nuôi trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường LB có bổ sung 50 µg/ml Km (Kanamycin). Quá trình nuôi cấy được tiến hành trong 28 giờ ở 370
C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, tỷ lệ tiếp giống là 0,1% (v/v). Sau mỗi hai giờ nuôi, dịch huyền phù tế bào của chủng E. coli BL21 tái tổ hợp được thu để xác định mật độ quang ở bước sóng 600 nm (OD600). Tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng bằng phần mềm excel để tìm thời điểm sản xuất sinh khối thích hợp.
2.3.8. Nghiên cứu Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp