3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
2.3.4. Phương pháp xác định và tính số lượng E.coli
Nguyên tắc:
Hút 0,1 ml mẫu sau khi đã pha loãng nhỏ vào trung tâm đĩa thạch EMB, dùng que tran cấy tiệt trùng trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Mỗi nồng độ chúng tôi tiến hành nuôi cấy 2 đĩa. sau đó đem ủ trong tủ ấm 370C trong vòng 24h. Đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của E. coli.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Pha loãng mẫu:
Với mỗi mẫu chúng tôi chuẩn bị dãy 3 ống Eppendort tương ứng với 10-1, 10-2, 10-3. Hút 0,9 ml dung đệm pepton vào mỗi ống, sau đó dùng micropipette hút 0,1ml dịch mẫu cho vào ống thứ nhất ta được nồng độ pha loãng 10-1, trộn đều mẫu. Tương tự ta lấy 0,1ml dịch mẫu 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 0,9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có độ pha loãng 10-2. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn.
Bước 2: Nuôi cấy vi khuẩn:
Chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp, dùng micropipet hút 0,1ml dung dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào đĩa EMB. Tương ứng với mỗi nồng độ pha loãng ta cấy lên 2 đĩa. Dùng tran cấy vô trùng tran đều lên bề mặt đĩa thạch theo chiều trên xuống dưới, từ trái qua phải. Lưu ý thao tác phải nhẹ nhàng tránh làm rách bề mặt thạch. Khi thấy bề mặt thạch khô đều, dùng bút đánh dấu đĩa và đem ủ trong tủ ấm với nhiệt độ ở 36 – 38oC trong 24 - 48 giờ.
Bước 3: Đọc kết quả
Sau 24h lấy các đĩa ra và đếm kết quả. Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli trên môi trường EMB có màu tím ánh kim, hoặc màu lông chuột, mọc đơn lẻ, từng khóm và phân bố đều trên bề mặt đĩa thạch.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 30 – 300 để tính kết quả.
Tính sốlượng vi khuẩn E. coli:
- Xác định số vi khuẩn E. coli có trong 1ml nước:
+Đếm số khuẩn lạc trên mỗi đĩa, sau đó nhân với 10 (vì chúng tôi chỉ hút 0,1ml dung dịch mẫu pha loãng đem trang cấy).
+Tính giá trị trung bình của các đĩa.
- Xác định tổng số vi khuẩn E. coli/m3 không khí tính theo công thức của V. Omealransky:
X =
Trong đó: A: Tổng số khuẩn lạc đếm được trong 5 đĩa thạch S : Diện tích của đĩa petri (cm2)
K : Hệ số tương ứng với thời gian đặt đĩa (15 phút ứng với K= 3)
100 : Diện tích quy ước cm2
100 : Hệ số tính chuyển thành m3
- Xác định tổng số vi khuẩn E. coli/100cm2:
+ Tính giá trị trung bình cho mỗi đĩa ở tất cả các nồng độ pha loãng.
+ Giá trị trị thu được đem nhân với 100 (vì nuôi cấy 0,1ml/đĩa môi trường từ 10ml dung dịch mẫu ban đầu).
+ Kết quả thu được đem chia cho 4 đối với mẫu swab thân thịt, chia cho 5 đối với mẫu lau sàn mổ, nền chuồng nhốt. Vì mỗi mẫu được lấy từ 4 vị trí (4x100cm2), hoặc 5 vị trí (5x100cm2).
- Xác định số lượng vi khuẩn trung bình ở các mẫu:
Trong đó: Xi là giá trị của từng mẫu
n là số lượng mẫu
Trong đó: Xi là giá trị của mẫu
là giá trị trung bình các mẫu
n là số lượng mẫu