2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu sinh lý và hóa sinh liên quan ủến tớnh chịu hạn
2.2.2.1. Chỉ tiờu ủỏnh giỏ nhanh khả năng chịu hạn [3]
Hạt giống ủược gieo trong cỏc chậu trồng cõy ủể trong phũng chiếu sáng nhân tạo. Sau khi cây có 4 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cỏch ngừng tưới nước ủến khi cõy cú lỏ hộo ủầu tiờn xuất hiện. Tiến hành theo dừi mức ủộ hộo của cõy trong 5 ngày kể từ khi lụ thớ nghiệm bắt ủầu cú cõy héo. Sau 5 ngày ựể hạn, tiến hành tưới nước phục hồi. đánh giá tỷ lệ cây không héo, cây phục hồi sau 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày. Các chỉ tiêu phân tích gồm: Tỷ lệ cõy khụng hộo, tỷ lệ cõy phục hồi và chỉ số chịu hạn tương ủối.
Khả năng chịu hạn tương ủối của cõy ủược biểu hiện bằng ủồ thị hỡnh rada, gồm các trục a, b, c, d, e, g và mang các trị số tương ứng an, bn, cn, dn, en, gn và chỉ số chịu hạn tương ủối ủược tớnh bằng ủồ thị rada theo cụng thức:
Sn = ẵsin α(anbn + bncn + cndn + dnen + engn + gnan) Gúc α ủược tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau và α = 600 Sn: Chỉ số chịu hạn tương ủối
n: Ký hiệu các giống nghiên cứu a: % cây không héo sau 1 ngày hạn b: % cây phục hồi sau 1 ngày hạn
c: % cây không héo sau 3 ngày hạn d: % cây phục hồi sau 3 ngày hạn e: % cây không héo sau 5 ngày hạn g: % cây phục hồi sau 5 ngày hạn Chỉ số chịu hạn càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao.
2.2.2.2. Hệ số hộo của ủất
Xỏc ủịnh thụng qua cỏc thụng số: dung ẩm toàn phần và ủộ ẩm gõy hộo [29]. Hệ số hộo của ủất ủược tớnh bằng cụng thức:
Hệ số héo = (Dung ẩm toàn phần – 21)/2,9 2.2.2.3. Hàm lượng nước trong mô khi cây héo
Khi cõy hộo ổn ủịnh, cắt lỏ (lỏ thứ 3 từ trờn xuống) trờn cựng tầng của mỗi giống, mỗi công thức cắt 10 lá, lặp lại 3 lần. Hàm lượng nước trong mô
khi cõy hộo ủược xỏc ủịnh bằng phương phỏp khối lượng [29] và ủược tớnh theo công thức:
% 100
% = − ì B
b
A B Trong ủú: A%: Hàm lượng nước tổng số trong cõy B: Khối lượng thõn và lỏ tươi ban ủầu (gam) b: Khối lượng khô của thân và lá sau khi sấy (gam) 2.2.2.4. Hàm lượng nước liên kết trong mô lá
Lỏ của mỗi giống ủược cắt vào buổi sỏng, trờn cựng tầng (lỏ thứ 3 từ trờn xuống) mỗi cụng thức cắt 10 lỏ, lặp lại 3 lần. Xỏc ủịnh hàm lượng nước liên kết trong mô lá bằng phương pháp của Dhopte (2002) [84].
Hàm lượng nước liờn kết ủược tớnh theo cụng thức sau:
W = (F – D)/(T-D) ì100
Trong ủú: W: Hàm lượng nước liờn kết; F: Khối lượng tươi của mẫu; D: Khối lượng khô của mẫu; T: Khối lượng mẫu khi bão hòa nước.
2.2.2.5. Khả năng giữ nước của mô lá
Cỏc lỏ ở mỗi giống ủược lấy cựng tầng (lỏ thứ 3 từ trờn xuống) vào buổi sỏng, mỗi cụng thức lấy 10 lỏ, lặp lại 3 lần. Sau khi lỏ ủược cắt rời khỏi cõy, ủược ủưa ngay vào tỳi nilon ủể hạn chế sự mất nước. ðem lỏ về phũng thớ nghiệm và ủem cõn ngay bằng cõn phõn tớch. Khả năng giữ nước của lỏ ủược xỏc ủịnh theo phương phỏp của Kozushco [20].
Khả năng giữ nước của mụ lỏ ủược tớnh theo cụng thức:
( )
( ) 100 %
% ì
−
= −
V B
b A B
A%: Khả năng giữ nước của mô lá (tính bằng
% lượng nước mất /lượng nước tổng số).
B: Khối lượng lỏ tươi ban ủầu (gam) b: Khối lượng lá sau khi gây héo (gam) V: Khối lượng khô của lá sau khi sấy (gam) 2.2.2.6. Hàm lượng diệp lục tổng số và diệp lục liên kết
Hàm lượng diệp lục tổng số ủược xỏc ủịnh theo phương phỏp của Wintermans, De Mots, diệp lục liờn kết ủược xỏc ủịnh theo Shmatco [29].
Hàm lượng diệp lục tổng số ủược tớnh theo cụng thức:
A =
100 .
. p
V C Trong ủú:
C: Nồng ủộ diệp lục cú trong dịch chiết Ca: (mg/l) = 12,7 . E663 – 2,69 .E645 Cb: (mg/l) = 22,9 . E645 – 4,68 . E663 C(a+b): (mg/l) = 8,02 . E663 + 20,2 . E645
V: Thể tích dịch chiết sắc tố p: trọng lượng mẫu
A: Hàm lượng diệp lục trong mẫu tươi (mg/g chất tươi)
2.2.2.7. Huỳnh quang diệp lục
Chỉ tiờu huỳnh quang diệp lục ủược xỏc ủịnh bằng mỏy Chlorophyll fluorometer OS 30 – ADC (Anh). Hệ thống gồm thân máy có màn hình hiển thị dữ liệu gắn với ủầu ủo gọn nhẹ, rất thuận lợi cho nghiờn cứu ủồng ruộng.
Ánh sỏng của mỏy ủược cung cấp bằng ủốn halogel 35W, ỏnh sỏng ủiều biến.
Mỏy sử dụng ủầu dũ PIN photodiode với kớnh lọc 700 ~ 750 nm. Hệ thống kẹp adaption clip cho phộp ủo nhiều mẫu cựng một lỳc. Dựng adaption clip kẹp mẫu lỏ (vị trớ giống nhau ở tất cả cỏc giống) 10 phỳt trước khi ủo (ủể cỏc trung tâm phản ứng ở trạng thái “mở” hoàn toàn, nghĩa là toàn bộ chất nhận ủiện tử ủầu tiờn trong chuỗi vận chuyển ủiện tử quang hợp – Quinon A (QA) ở trạng thỏi oxy húa. Dựng ủầu ủo khớp với adaption clip, ấn nỳt ủo mode trờn thõn mỏy. Cỏc tham số ủo ủược gồm: F0 (huỳnh quang ổn ủinh), Fm (huỳnh quang cực ủại), Fvm (huỳnh quang biến ủổi) hiển thị trờn màn hỡnh thõn mỏy và ủược lưu giữ trong thẻ nhớ. Fvm phản ỏnh hiệu quả sử dụng năng lượng ỏnh sỏng trong phản ứng quang húa, ủược xỏc ủịnh bằng cụng thức:
Fvm = (Fm - F0)/ Fm
2.2.2.8. Áp suất thẩm thấu của mô lá
Xỏc ủịnh ỏp suất thẩm thấu của mụ lỏ bằng phương phỏp so sỏnh tỷ trọng dung dịch [29].
Áp suất thẩm thấu ủược tớnh theo cụng thức: P = i.C.R.T
Trong ủú: P: Áp suất thẩm thấu (atm) C: Nồng ủộ dng dịch (M)
R: Hằng số khí = 0,0821 T: 273 + t0C
t0: Nhiệt ủộ tại thời ủiểm thớ nghiệm i: Mức ủộ ủiện ly: i = 1+α(n-1) α: Hệ số ủiện ly
n: Số ion phân ly của phân tử chất hũa tan (ủối với chất khụng ủiện ly) 2.2.2.9. Hoạt ủộ enzym α-amylase
Hoạt ủộ của α-amylase ủược xỏc ủịnh theo phương phỏp của Miller G.L (1959) [156]. Dựa trên nguyên tắc α-amylase thủy phân tinh bột thành cỏc oligosacarit và glucose cú tớnh khử, cú khả năng bắt màu vàng cam ủặc trưng với thuốc thử DNS khi ủun núng.
2.2.2.10. Hàm lượng ủường khử
Hàm lượng ủường khử ủược xỏc ủịnh theo phương phỏp của Miller G.L (1959) [156]. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa ủường khử với thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS). Cường ủộ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng ủộ ủường khử trong một phạm vi nhất ủịnh. Hàm lượng ủường khử ủược tớnh theo cụng thức sau:
Y = 15,759. X + 0,5181 (àmol/ml)
(Cụng thức suy ra từ việc lập ủồ thị chuẩn xỏc ủịnh hàm lượng D-glucose bằng DNS). Trong ủú: Y: Hàm lượng D-glucose trong 1 ml dung dịch.
X: Giá trị OD540nm tương ứng 2.2.2.11. Hàm lượng axit amin prolin
Hàm lượng prolin trong lỏ ủược xỏc ủịnh theo phương phỏp của Bates (1973) [61]. Mẫu lỏ ủược nghiền kỹ trong dung dịch axit sulfosalicylic 3%, thu dịch và tiến hành bắt màu với ninhydrin. ðo ủộ hấp thụ quang của dịch chiết trờn mỏy quang phổ ở bước súng 520 nm. Hàm lượng prolin trong lỏ vừng ủược xỏc ủịnh theo phương trỡnh ủồ thị chuẩn prolin.
Dựng ủồ thị chuẩn prolin: Pha prolin chuẩn ở cỏc nồng ủộ àg/ml: 0,01; 0,03; 0,07;
0,1; 0,2 và 0,3. Lập ủường chuẩn và hàm lượng prolin ủược tớnh theo cụng thức:
Y = 1,4083 . X + 0,014 .
Trong ủú X: giỏ trị ủo ủược OD520nm; Y: hàm lượng prolin (àg/ml).