Sử dụng 26 mồi RAPD bao gồm 6 nhóm mồi: OPA, OPB, OPC, OPE, OPM, BIỌ Nhóm mồi BIO có nguồn gốc từ Korean Bio Tech Inc, 5 nhóm mồi còn lại ñược cung cấp bởi hãng Operon, Mỹ. Ký hiệu và trình tự của các
ñoạn mồi như sau:
Bảng 2.3. Danh sách mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên mồi Trình tự STT Tên mồi Trình tự
1 OPA-02 5’-TGCCGAGCTG-3’ 14 OPA-01 5’-CAGGCCCTTC-3’ 2 OPA-04 5’-AATCGGGCTG-3’ 15 OPA-02 5’-TGCCGAGCTG-3’ 2 OPA-04 5’-AATCGGGCTG-3’ 15 OPA-02 5’-TGCCGAGCTG-3’ 3 OPA-11 5’-CAATCGCCGT-3’ 16 OPA-12 5’-TCGGCGATAG-3’ 4 OPA-15 5’-TTCCGAACCC-3’ 17 OPA-19 5’-CAAACGTCGG-3’ 5 OPA-18 5’-AGGTGACCGT-3’ 18 OPC-02 5’-GTGAGGCGTC-3’ 6 OPB-01 5’-GTTTCGCTCC-3’ 19 OPC-04 5’-CCGCATCTAC-3’ 7 OPB-05 5’-TGCGCCCTTC-3’ 20 OPC-07 5’-GTCCCGACGA-3’ 8 OPB-07 5’-GGTGACGCAG-3’ 21 OPC-13 5’-AAGCCTCGTC-3’ 9 OPB-08 5’-GTCCACACGG-3’ 22 OPC-19 5’-GTTGCCAGCC-3’ 10 OPB-15 5’-GGAGGGTGTT-3’ 23 OPE-07 5’-AGATGCAGCC-3’ 11 BIO-07 5’-GGTTCGCTCC-3’ 24 OPE-08 5’-TCACCACGGT-3’ 12 BIO-08 5’-GGACTCGAGT-3’ 25 OPM-06 5’-CTGGGCAACT-3’ 13 BIO-16 5’-TCGAGACGGA-3’ 26 OPM-13 5’-GGTGGTCAAG-3’ Thành phần và nồng ñộ các chất trong phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR Thành phần 1X (µl) Nước cất khử ion 4,0 Dung dịch ñệm 10X 1,5 dNTPs (2,5mM) 1,5 MgCl2 (25mM) 1,5 Mồi (20ng/µl) 3,0 Taq Polymerase 5U 0,5 AND 20ng/µl 3,0 Tổng 15,0
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR - RAPD. Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel agarose 1,8%.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Biến tính 940C 4 phút Biến tính 930C 1phút Gắn mồi 360C 40 giây Tổng hợp 720C 1 phút 44 chu kỳ Tổng hợp cuối 720C 4 phút Bảo quản 40C ∞
Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel agarose 1,8%, soi gel trên ñèn UV và chụp ảnh.
- Phương pháp phân tích số liệu: Các băng ADN là sản phẩm PCR
ñược nhập vào chương trình Excel theo quy tắc: hiện băng ñánh số 1, không hiện băng ñánh số 0. Số liệu nghiên cứu ñược phân tích bằng chương trình NTSYS pc 2.1 ñể xác ñịnh hệ số tương ñồng của từng cặp ñối tượng theo phương pháp Jaccard. Xây dựng ma trận tương ñồng biểu hiện cho mối quan hệ gần xa về mặt di truyền và sơ ñồ hình cây biểu diễn mối liên kết di truyền giữa các mẫu nghiên cứụ Hệ số PIC (Polymorphism Information Content) của mỗi mồi ñược xác ñịnh theo công thức PIC = 1-∑Pij2, trong ñó Pij là tần số allen thứ j của kiểu gen i ñược kiểm trạ Phạm vi giá trị PIC từ 0 (không ña hình) tới 1 (ña hình hoàn toàn).
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu liên quan ñến năng suất và phẩm chất hạt vừng phẩm chất hạt vừng
2.2.4.1. Năng suất vừng
Xác ñịnh các yếu tố cấu thành năng suất: Số quả/cây, số hạt chắc/quả, khối lượng 1000 hạt của mỗi giống ñược xác ñịnh ở 30 cây ngẫu nhiên (theo
nguyên tắc ñường chéo). Năng suất thực thu (tạ/ha) ñược tính từ năng suất thực thu trên các ô thí nghiệm, sau qui ñổi ra tạ/hạ
2.2.4.2. Hàm lượng lipit tổng số
Hàm lượng lipit ñược xác ñịnh theo phương pháp trực tiếp trên hệ
thống bán tựñộng Soxhlet của hãng Gerhardt [4], [30].
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hòa tan của dung môi hữu cơ
(petroleum ether) ñể chiết rút lipit ra khỏi nguyên liệụ Hàm lượng lipit ñược tính theo công thức:
% 100 × − = G Gc Gm X Trong ñó:
X: Hàm lượng lipit có trong nguyên liệu ởñộ khô tuyệt ñối (%)